分享一篇2022年发表在Nat. Commun.上的文章，题目是“Autoinducer-fluorophore conjugates enable FRET in LuxR proteins in vitro and in cells”。文章的通讯作者为威斯康星大学麦迪逊分校化学系Helen E. Blackwell教授。
许多常见细菌通过称为群体感知（QS）的化学信号传导机制以种群依赖性方式调节重要表型。革兰氏阴性菌通常使用 N-酰基-L-高丝氨酸内酯 （AHL） 信号来检测 QS1，由LuxI/ LuxR合酶 - 受体系统调节，首先在生物发光共生体Fischeri中描述（图1a)。LuxI型合酶产生AHL信号，一旦达到足够的浓度，同源细胞内LuxR型蛋白选择性地与该AHL结合，从而达到定额细胞密度。LuxR型受体是控制QS调节基因表达的转录因子;AHL结合可以介导LuxR型受体与DNA的结合（对于更常见的激活剂类）或其与DNA的解离（对于更罕见的抑制剂类）。几种突出的革兰氏阴性细菌病原体使用基于LuxI / LuxR的QS在高细胞密度下调节各种毒力表型，包括毒素的产生和生长成无柄生物膜。因此，QS作为控制人类细菌感染的目标，最近引起了大量关注，并且许多化学生物学方法旨在破坏这种通信过程以减弱细菌毒力。
对QS抑制的大量研究集中在阻断天然AHL信号与其同源LuxR型受体的结合上;在过去20年或更长时间中，几种LuxR型受体的小分子调节剂一直是本研究的主要焦点。然而，需要进一步的研究来提高这些化学探针的效力选择性和理化性质。
基于荧光的技术代表了一些用于研究配体 - 受体相互作用的最灵敏，最可靠的测定方法。尽管仅限于CarR，色氨酸荧光猝灭方法很好地证明了它们的使用，但依赖于观察载脂突受体和受体-配体复合物（或两种不同的受体-配体复合物之间）的荧光强度的微小差异。绕过这种复杂性的一种策略是使用福斯特共振能量转移（FRET）。
在这篇文章中，报告了一组合成AHL-荧光团偶联物的设计和构建，六种特异性LuxR型受体-FRET-探针对的鉴定以及该FRET测定在体外和细胞中的应用，以收集非自然AHL与LuxR型蛋白质的定量结合数据。（如图1e所示）利用产生与弱激动配体结合的LuxR型蛋白质的能力，以及随后用目标配体取代这些弱激动剂的能力，该技术首先被证明是可行的。但在很大程度上尚未进一步开发。该FRET测定为描绘LuxR型受体抑制和活化的基本分子机制，开发LuxR型受体的小分子调节剂作为化学工具，以及进一步探索QS作为抗病毒靶标提供了强有力的新切入点。
图 1：LuxR 型 QS 受体的内在色氨酸 FRET 检测设计。本文设计了一个FRET探针库，将高丝氨酸内酯（HSL）（图1a插图）头组融合到具有可变连接子长度的荧光团中（1-16;图2a）。合成了一个基于AHL的FRET探针的小型文库，其中HSL通过标准溶液相偶联反应与具有不同长度的脂肪族连接子的丹酰基或7-羟基香豆素荧光团相连（图2a）。对 FRET 探针库进行筛选，以筛选以下七种 LuxR 型受体的大肠杆菌β半乳糖苷酶报告基因株中的激动剂（图 2b）和竞争性拮抗作用。在几乎所有受体中都鉴定出有效的激动剂（图2b），香豆素衍生物通常不如丹酰衍生物活性高。相比之下，没有发现有效的拮抗剂。这表明（如果这些探针靶向AHL结合位点）这些LuxR型受体的结合口袋可以扩展以完全容纳这些大配体，或者它们的长尾巴能够伸出结合口袋。为每个受体选择至少三个激动性FRET探针（如图2b中红色和蓝色球体所示）。
接下来，本文研究了AHL-荧光团探针在与LuxR型受体结合时产生FRET信号的能力，以及该技术作为体外结合测定的应用。本文使用FRET探针DA4进行QscR的这些初步研究，因为它的EC50在基于细胞的报告器（133 nM）中，OHHL（纯化配体）和OdDHL（天然配体）之间是属于中间位置的，这表明DA4既可以取代任何剩余的结合OHHL，又可以在未来的置换测定中允许配体交换（如图3a所示）。首先，本文研究了QscR-DA4复合物是否可以产生FRET信号。将DA4引入到1μM下纯化的QscR-OHHL复合物中，在室温下孵育30分钟，在280nM下激发并在530nm处测量强发射信号（图3b）。为了确定该激发信号是否对QscR-DA4结合具有特异性，测量了几种对照样品的荧光：QscR-OHHL加丹酰胺（DNSA），缺乏HSL头组且在QscR中无活性的亲本荧光团（图2b）;DA4加牛血清白蛋白作为非特异性蛋白质对照；和QscR-OHHL加DA4在高浓度存在竞争天然配体（OdDHL）的情况下。与QscR配体结合位点中DA4特异性结合产生的FRET一致，在这些对照实验中没有观察到明显的荧光发射（图3b）。接下来，通过测量不同浓度的DA4的FRET来确定QscR-DA4相互作用的亲和力（图3c）。设计了这个实验，这样就可以计算出一个解离常数（Kd）。本文还试图探索QscR中DA4的位移是否可以用作确定其他配体结合亲和力的一般测定。对于体外FRET配体置换实验，本文将不同浓度的竞争配体添加到5 nM QscR和2μM DA4的溶液中，然后测量FRET。竞争置换剂量-反应曲线如图3d（激动剂）和图3e（拮抗剂）所示。计算得到OdDHL具有半个最大抑制浓度（IC50）位移测定中82 nM的值（图3d）和结合亲和力（Kd）为 1.3 ± 0.4 nM 时使用 Cheng-Prussoff 方程 （方法） 进行转换。这种亲和力与先前研究中报告的QscR-OdDHL的3.1 nM亲和力相当。本文想进一步研究在基于细胞的报告基因测定中测量的配体的效力与在体外FRET置换测定中测量的配体的亲和力之间的关系。QscR FRET测定（图3g）中的值显示它们是高度相关的（Pearson系数r = 0.9），表明基于细胞的转录报告者效力，至少对于QscR而言，是受体亲和力准确代表。
图 3：体外 FRET 检测的开发。
将大肠杆菌细胞在无AHL缓冲液中稀释至低细胞密度以促进OHHL解离，洗涤三次以除去任何未结合或解离的OHHL，然后与DA4一起孵育用于结合测定或DA4加竞争配体用于竞争测定（示意性地显示在图4a中）。从不产生QscR的细胞的FRET信号中减去诱导细胞的FRET信号，以除去由非特异性结合相互作用引起的FRET信号。
图 4：细胞内 FRET 检测的开发。
本文测量了DA4和细胞中产生的QscR-OHHL复合物之间的FRET信号，并在添加DA4时观察到530nm处的强烈FRET发射（图4b）。与体外测定一样，这种发射是特定于DA4的存在，并通过添加OdDHL消除，这表明竞争性配体位移。通过在产生QscR-OOHL的稀大肠杆菌细胞存在下改变DA4的量来获得表现良好的配体结合曲线（图4c）。接下来，通过应用细胞内FRET测定来测量激动剂（图4d）和拮抗剂（图4e）的配体位移，类似于上面的体外FRET测定。这些细胞内测定显示出高信噪比，从而实现了稳健的模型拟合。该置换测定的Z因子为0.72，表明该测定与体外方法一样，易于应用于高通量筛选（图4f）。当与上面讨论的配体过度表达时，每个受体（CepR除外）在其配对探针存在下产生强大的FRET信号，并且在添加竞争配体时该信号被消除（图5a），信噪比范围为12至177。与CepR相比，LasR FRET信号高度依赖于增溶配体的选择（图5b），与弱结合的OOHL相比，当被紧密结合的OdDHL溶解时，LasR的FRET信号低13倍。
图 5：QscR 以外受体的 FRET 分析数据。这里描述的 FRET 分析应该能够解决许多关于 LuxR 型蛋白质活性的基本的问题。为了探索这种化合物是否可以直接与 SdiA EC和其他 LuxR 型受体结合，本文在 SdiA EC 、SdiA SE 、CviR 和 QscR 的细胞内 FRET 置换试验中测试了吲哚，并观察到 FRET 没有降低，表明吲哚至少在这四种受体中不结合 AHL 结合口袋或阻止 LuxR-AHL 结合（图6a）。发现C-30和PD-12确实能够部分取代DA1，尽管浓度非常高（1 mM）;V-06-018以中间亲和力取代DA1，并且正如预期的那样，TP-1能够从LasR中取代DA1，其效力与其天然配体OdDHL相似（图6b）。
综上所述，本文报告了使用位于LuxR 型受体-配体结合口袋中的保守内源性色氨酸和新的荧光团-AHL偶联物分别作为荧光供体和受体的 FRET 测定探针。发现内在FRET 可用于测量体外与纯化蛋白和使用大肠杆菌过表达菌株的细胞中配体结合亲和力的差异。使用一组离散的FRET 探针证明了该检测在六种经过充分研究的 LuxR 型受体中的兼容性。最后，表明了这些结合测定可用于解决有关已知 LuxR 型受体或 QS 调节剂的靶标和相对活性的几个基本问题，并允许直接解决配体结合亲和力和受体稳定性之间的关系。这种 FRET 测定提供了一种直接的方法来识别这些配体，作为转录组学的起点，以查明可能受该受体类别调节的基因。总体而言，这些测定提供了优化已知合成 QS 调节剂、表征新的或推定的天然 QS 信号、检查 LuxR 型受体的生物物理特性和推进 QS 领域的途径。
原文链接：https://www.nature.com/articles/s41589-022-01089-1
目前评论：