荧光传感在灵敏度、选择性和实时原位检测等方面具有突出优势，可以快速精确的对被分析物进行识别与检测。但就目前光学检测而言，通常是利用一些如荧光光谱、紫外-可见吸收光谱、圆二色谱、96孔读数板等专用仪器进行光谱测量，但这些仪器通常很昂贵，不易于现场直接检测，并且操作耗时等缺陷。
针对解决上述问题，本课题组提出了一种通过摄影技术对荧光色度和光度进行数字分析，以定性和定量分析未知物的方法。文中作者合成了七种荧光波长分布不同的探针分子，分别用于检测pH值、半胱氨酸、水合肼、硫化氢、过氧化氢和金属钯离子的响应变化 (Figure 1)。其中，探针1，2，5和6产生比率信号的变化，探针3，4和7为增强型信号。
作者使用一部手机、96孔板、紫外灯和暗箱替代复杂的信号检测仪器，拍摄收集化学反应产生的荧光图像，监测信号变化。通过对每个摄影图像进行程序软件分析，对其像素值采样，再映射到CIE1931 xyY标准色空间后，对照片图像进行数字处理以生成色度/光度与浓度之间的校准曲线，然后与未知样品的色度/光度进行比较，进而计算出未知分析物的含量 (Figure 2)。
Figure2荧光色度和光度对未知分析物定量分析的设计策略示意图
为验证该方法的可靠性，作者将摄像技术分别与色度和光度结合分析探针对pH值、半胱氨酸、水合肼、硫化氢进行选择性响应，并对获得的图像进行数字处理，得到色度/光度与浓度之间的校准曲线 (Figure 3)。
从图中可以看到，探针1随着pH的降低，1-10孔的荧光图像从绿色变为红色，样品的色度在xy空间中呈线性趋势；探针2随着Cys剂量的增加，荧光图像的颜色从蓝色变为黄色，随着半胱氨酸浓度的增加，样品的色度在xy空间中也遵循良好的线性关系。探针3和探针4的图像亮度逐渐增加，而颜色成分保持不变，代表像素仅在光度上发生变化；探针3样品的光度随水合肼浓度的增加呈良好的线性趋势(R2= 0.98)；探针4随着硫化氢浓度的增加，样品的光度在Y空间呈良好的线性趋势(R2 = 0.99)。
Figure 3 比率型荧光探针1(A)和2(B)的荧光色度变化；增强型荧光探针3(C)和4(D)的荧光光度变化；探针3(C中的插图)荧光度与NH2NH2剂量以及探针4(D中插图)荧光度与H2S剂量之间呈线性关系
以上结果表明，校准样品的色度与光度在xy或Y空间呈良好的线性分布，为未知样品的检测提供校准曲线，证明了荧光色度和光度可以作为检测分析物的有力工具。基于此结果，作者利用该方法实现了通过标准样品和校准曲线对未知分析物的定性和定量分析(Figure 4)。
Figure 4探针5(A)和6(B)标准样品和未知样品的摄影图像和色度分析，1-10孔表示已知浓度的标准样品；a-j为未知样品；探针7(C)标准样品和未知样品的摄影图像和光度分析，其光度与pH值呈良好的线性关系(R2 = 0.99)；(D)探针5、6、7与H2O2、Pd2+和H+的反应式在此基础上，作者对所有含有未知分析物的孔进行计算，得到样品的理论剂量，与实际加入剂量进行比较，并进行误差分析(Table 1)。
Table 1 探针5,6,7定量分析未知样品的误差
从表中可以看出，所有的误差都在20%以下，且(a)样品在检测Pd2+时的样本误差为零。总体而言，所有误差的标准差为4.67%，进一步证实图像分析方法的可靠性。
综上所述，作者提出了通过摄影技术利用荧光色度和光度对待测物进行鉴别和定量分析的策略，展示了一个简单、快速、可现场检测的便携式装置的分析方法，为荧光探针分析检测提供备选工具，展现良好的应用前景。同时，利用荧光色度和光度技术对未知样品进行低误差的线性标定和定量分析，证明了该方法的可靠性，为未知分析物的定量检测提供了新思路。此外，该方法的局限性在于对未知样品的检测，必须每次使用标准样品进行校准，而且将这种摄影技术应用于复杂环境下的生物成像检测仍是一个挑战。
原文链接：https://doi.org/10.1016/j.cclet.2020.07.012
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