分享一篇发表在JACS上的文章，A Photoactivatable Formaldehyde Donor with Fluorescence Monitoring Reveals Threshold To Arrest Cell Migration。文章的通讯作者为美国伊利诺伊大学香槟分校的Jefferson Chan 教授。

一个能够控制复杂生物网络系统各物质扰动的化学工具，是生物信号传输的强有力手段，例如酶抑制剂。但是对于许多反应活性高、低寿命的分析底物（例如甲醛，活性氧、氮、硫、碳）来说，很难通过外部添加来维持体内特定细胞等固定位置的浓度，进而不利于酶与之作用效果的分析。因此，各种供体（Donors）应运而生，通过自发、酶促和光介导活化等特定方式，从分子中释放出来，进入生物体系中。其中，光活化因可以改变光的强度、光照时间以及聚焦位点，成为最易调控的方式，已经实现了对活性氧、氮、硫、碳及金属离子的可控释放。但是，目前并没有一种可光活化供体分子来实现对生物醛的调控，更没有结合荧光信号的变化将醛类的释放定量化。

     如图1a所示，系列探针中包含具有光敏感单元的邻硝基苄基(nitrobenzyl)，通过缩醛(acetal)连接了硅基荧光素(silicon-xanthene)染料。其中，硅烷基荧光团由于电子推拉作用(electronic push−pull system)受阻以及来自硝基上光致电子转移(d-PeT)作用，发生淬灭而不发荧光。光辐射之后探针被活化，如图1b所示，形成了不稳定的半缩醛，进一步断裂形成了甲醛和对应的染料母体，产生荧光信号放大。在对三种探针效果验证的过程中发现，photoFAD-1具有低的量子产率，光漂白性差，而photoFAD-2在生理环境下发生向细胞膜外的被动扩散。此后，作者通过引入三氟甲基(trifluoromethyl moiety)和氯取代基(chloro substituents)来提高探针的光漂白性和在阴离子生理条件下的停留稳定性，合成了探针photoFAD-3（图1c）。实验部分，作者首先在体外对探针photoFAD-3和前体化合物4进行了光物理性质测试和对比实验。如图2a所示，吸收光谱和发射光谱表明，化合物4具有荧光而探针photoFAD-3在光照前无荧光产生。当对探针进行一段时间的连续照射之后(60 min)，探针photoFAD-3产生了一个139倍的荧光稳定增强，不发生光漂白导致荧光消失现象（图2b, c）。并且，对探针photoFAD-3光照之后，作者依次通过质谱和同位素标记确定了化合物4以及半缩醛的产生，从而在结构上验证了甲醛的生成。此外在补充实验中，进一步考察了探针的化学和光稳定性。在图2d中也显示了其良好的细胞相容性。

接下来，作者致力于建立一种在活体中利用探针photoFAD-3定量化甲醛释放的计算规则。首先，将探针photoFAD-3 和HEK293细胞孵化后，进行了不同时间的光照，并在荧光显微镜和IVIS下成像，如图3a,b。之后将HEK293细胞进行裂解，裂解液再通过荧光光谱得到对应的荧光强度，所得荧光强度再带入到以化合物4为标准的参考曲线中，从而得出细胞裂解液中甲醛所释放出的浓度，如图3c,d。作者之后再补充计算了每个样品中的细胞数目和体积后，得出了每个细胞在光照180 s之后释放出了4.0 μM甲醛的结论，从而达到了对细胞内甲醛释放定量化的目的。

图3.探针photoFAD-3与HEK293细胞孵化后，不同光活化时间下，表观荧光(a)和IVIS成像(b)；(c)体外细胞裂解液的荧光与总辐射效率的关系曲线；(d)化合物4的荧光强度与浓度的参考曲线。

最后，作者将探针photoFAD-3用作衡量细胞对甲醛去毒化的能力，得到超过细胞代谢能力的甲醛的阈值。首先，合成了一种参照探针Ctrl-photoFAD-3，它不含半缩醛结构，因此不释放甲醛。将此探针(5 μM)与photoFAD-3分别与HEK293细胞孵化后，进行了180 s的光照。之后，将这两组细胞分别转移到伤口修复阵列中，观察细胞的迁移和增殖情况。如图4a，经过24h的对比发现，激活后的探针Ctrl-photoFAD-3对于伤口的愈合并不会造成任何影响，而激活后的探针photoFAD-3恰恰相反，并且随着光照时间的增长，细胞修复能力越来越差（图4b）。重要的是，当每个细胞中甲醛浓度低于2.2 μM时，对于伤口的恢复没有多大影响，但是当浓度高于2.2 μM时细胞停止修复，并且随着光照激活时间的增长，甲醛浓度过高，造成更大的伤口面积（图4c）。                                     

该文章首次提出了一种光活化甲醛供体荧光探针，实现在高时空控制下实现甲醛释放定量化、调整细胞内甲醛的水平。这种定量化的方法同时适用于不同的荧光测试工具和仪器。作者通过设计和实验，最终得出了单个细胞中甲醛增长的阈值为2.2 μM，在此浓度下不会影响伤口愈合过程中HEK293细胞的迁移和繁殖。这种光活性供体型荧光探针的可读化特性，为此后研究探针的药物搭载与传递、甲醛对干细胞衰老过程的影响奠定了基础。

编辑：王岩松

推送：初礼

文献链接：

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.9b11899