分享Nature Chemistry的文章A general strategy to develop cell permeable and fluorogenic probes for multicolour nanoscopy，文章的通讯作者是来自德国海德堡马克斯·普朗克医学研究所化学生物学系的Wang Lu和瑞士洛桑联邦理工学院化学科学与工程研究所的Kai Johnsson。

      将荧光显微成像和合适的荧光标记方法结合起来使用可以实现在活细胞内高时间分辨率下进行细胞的结构及生理过程观察和分析，但是这要求荧光探针有很好的细胞膜透过性、染色的特异性及强度以及各种合适的颜色，而目前的探针很难满足所有的需求。基于罗丹明的荧光探针目前最适合也已经广泛用于活细胞荧光标记，它本色以两性离子存在的发光状态和以螺环形式存在的不发光状态之间有很好的动力学平衡，能能够兼顾通透性和荧光强度，但是在和其他配体结合后的性质不佳。虽有加入吸电子基团等办法来进一步优化两种状态之间的平衡，但是对萤光量子效率有影响。

      在这里，作者在不改变罗丹明光谱性质的状态下实现对其细胞通过性的优化，并发展了多色探针可以同时标记不同蛋白，并在免洗的条件下实现对活细胞的多色共聚焦成像及超分辨显微成像。

      作者从罗丹明两种状态的出发进行了衍生探针设计，他们尝试在内酰胺键上链接不同吸电子基团来减少螺环内酰胺的稳定性，以首先增加细胞膜透过性。基于6-TAMRA的结构，通过三步反应在酰胺的N上链接不同的吸电子基团。这些衍生探针本身在水溶液中不发荧光；而用由吸收光谱强度计算得到的D50值表征两性离子和螺环形式之间的平衡，发现已报到的衍生探针和新衍生探针的D50值有一定相似性。这些衍生的探针没有改变罗丹明本身的光谱性质，作者认为这些探针是有潜力应用于活细胞荧光成像的。

     之后在体外有无蛋白两种状态下以及稳定表达核定位的自标记SNAP-Halo融合蛋白的U2OS细胞上进行荧光测试。将不同的连接基团和不同的衍生荧光探针进行连接，最终通过tag将荧光团标记到tag自身上。这一过程中找到了引入N，N-二甲基磺酰胺基的MaP555-SNAP/MaP555-Halo两种在活细胞上标记效果最佳的荧光探针，也证明了设计思路的有效性。同时，带有MaP555荧光团的探针在与微管或肌动蛋白特异性结合的小分子相互连接后还能实现在活细胞内对两种蛋白的标记，其荧光颜色与已有的近红外荧光SiR探针不同，而标记效果优异。

       进一步希望将这种设计方法拓展到更多颜色的罗丹明荧光探针的设计之中。对于青蓝色的罗丹明R110，由于其D50值和6-TAMRA相似，因此尝试加入N，N-二甲基磺酰胺基产生MaP510，得到了活细胞上更好的标记效果。对于橙色的卡波吡宁，对其进行了相似的多种衍生并进行筛选，发现了加入N，N-二甲基磺酰胺基的MaP618在体外和活细胞上也都有很好的荧光效果，同时也可以很好的用于肌动蛋白的特异性荧光成像。他们还对已有的SiR700这种近红外荧光探针进行改造，加入了酰基氰胺基团这种最强的吸电子基团得到MaP700，使其活细胞内成像的能力大大增强。

      这一系列的结果说明，罗丹明荧光探针的两性离子形式和螺环形式之间的平衡以及探针-蛋白之间的相互作用都会影响最终的标记情况；而在内酰胺上对加入的基团进行不同的设计，可以对探针细胞膜透过性、荧光效果和亮度进行优化，实现更好的标记效果。此外，她们将优化得到的不同颜色的探针以不同的标记方法同时用于活细胞的成像之中，第一次在免洗条件下，成功在共聚焦显微镜和STED显微镜下进行多色活细胞成像，同时还能实现对标记结构的动态变化的追踪或者多级组装的细节成像。

原文作者：MYZ

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41557-019-0371-1

原文引用：10.1038/s41557-019-0371-1