分享一篇2019年发表在Nature Chemistry上的文章，题目是“A general strategy to develop cell permeable and fluorogenic probes for multicolour nanoscopy”。文章的通讯作者为德国马普所的Kai Johnsson教授。荧光显微技术和荧光标记方法联合使用能够实现在活细胞水平上高时空分辨观察细胞结构和生物学的过程。为更好的实现这种目的，荧光探针设计和改造需要满足以下几种条件：（1）良好的细胞穿透性；（2）对目标物的特异性靶向；（3）高量子产率和光稳定性；（4）合适的激发和发射波长。罗丹明类染料具有高量子产率、结构易修饰、细胞毒性小以及无荧光的螺环结构与强荧光两性离子结构动态平衡的特点（图1a），被广泛应用在活细胞成像研究中。但是染料螺环与两性离子结构之间的动态平衡引发的荧光变化也在一定程度上限制了其在细胞成像中的亮度，基于此问题，本文作者提出了一种罗丹明染料的改造方法，将该染料的内脂结构变为酰胺结构（图1b），这种改造能够让其在生理环境中保持螺环的非荧光状态以提高其细胞通透性，靶向至目标物后螺环打开恢复强荧光的两性离子状态。这种改造方法在不改变罗丹明本身高量子产率的前提下，有效提高了罗丹明染料的细胞通透性，并且使该染料在靶向至目标物前保持在螺环状态，只有与目标靶向结合之后才恢复至强荧光的两性离子状态，这种改造实现了对活细胞的免洗高亮度成像。
有文献报道，将罗丹明内脂变为内酰胺结构导致其在生理条件下大部分分子依然处于无荧光的螺环状态，这就会大大影响其在细胞成像中的亮度，所以作者在内酰胺的氮原子上分别修饰了不同的吸电子基团，以调节其形成螺环后的稳定性（图1c）。作者在水/二氧六环组成的不同离子浓度溶液中测试了探针1-5的D50值（即探针吸收强度为最大吸收强度一半时对应的离子浓度），根据文献报道，当D50值为50时是最适用于成像研究的。从测试结果可以看出未经修饰的探针1的D50值大约是10（图1d），说明该结构在水溶液中主要以螺环的形式存在，而将内脂改造为不同取代基的内酰胺后，探针2-5的D50值增大至32-60，说明这种改造方式是非常有效的。对于细胞成像功能的研究，作者首先利用在细胞核中稳定表达SNAP-Halo融合蛋白的U2OS细胞中研究了含有SNAP蛋白靶向基团的罗丹明探针6-10（图2a）在相同浓度下的免洗成像能力，通过对比发现探针10对于蛋白的识别效率最高，得到的细胞图像中（图2c），细胞核和细胞质荧光强度对比倍数最高，而对应的内脂结构的探针6对于细胞核和细胞质的成像效果最差，说明其细胞通透性远不如改造后的探针。相同的对比结果在探针11-15中得到重现（图2e-h）。作者接着在含有肌动蛋白靶向基团（探针16，17）和微管蛋白靶向基团（探针18，19）的探针中修饰N,N-二甲基磺胺基（图2i-n），与未修饰的内脂结构对比，修饰后的探针细胞通透性明显提高，并且和已报道的定位探针对比，具有很好的共定位效果。
随后作者将这种改造方式拓展到不同结构和不同波长的碳基和硅基罗丹明母体中，从结果可以看出这种改造方式也同样可以使其它罗丹明类染料有效提高细胞通透性（图3c，3f，3i）。但比较特殊的就是探针39，由于硅基罗丹明本身的D50值为54，所以对应的最优氨基修饰基团也发生了变化。
最后作者将改造后的探针与商品化定位染料进行了共染色实验（图4a,b），实验结果表明不同定位功能的探针具有很好的靶向性。最后作者探索了这些探针在超分辨成像中的应用，从成像效果来看，改造后的一系列探针均具有很好的超分辨成像效果（图4c-e）。综上所述，作者在本文中介绍了一种具有很好的细胞穿透性及低背景超分辨荧光探针的普适设计方法，并通过特异性的蛋白靶向基团将这些探针成功应用于不同细胞器的定位中，并且在成像过程中免去了洗涤细胞这一过程。这些探针都是很好的超分辨活细胞成像功能，更重要的是这种设计方法能够为许多其它特定需求的探针设计提供了一种思路。
编辑：吴田宏
推送：初礼
文献链接：https://doi.org/10.1038/s41557-019-0371-1
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