活细胞荧光纳米显微镜是研究分子生物学细胞生物学的有力工具，但由于缺乏合适的荧光探针，其使用受到了限制。基于常规荧光团的荧光探针通常具有较低的细胞渗透性和非特异性背景信号。在这里，作者报告了将常规荧光团转化为具有优异细胞渗透性和低非特异性背景信号的荧光探针的一般策略：将若丹明及其相关荧光团中的羧基转化为缺电子的酰胺不会影响荧光团的光谱性质，但可以实现合理地调整两种不同形式之间的动态平衡：荧光两性离子形式和非荧光但细胞可渗透的螺内酰胺形式。此外，当探针与其细胞靶标结合时，平衡通常会朝着荧光形式转移，导致的荧光显著增强。使用这种简单的设计原理，作者及团队为不同的细胞靶标创建了多种颜色的荧光探针，用于免冲洗，多色活细胞共聚焦和超分辨率显微镜成像。

大多数适用于活细胞显微镜荧光探针的报告至今是基于罗丹明衍生物。罗丹明基探针在活细胞成像中的适用性的关键在于它们存在于非荧光螺内酯和荧光两性离子之间的动态平衡中：疏水的、非荧光的螺内酯比其两性离子对应物具有更高的细胞渗透性，并且探针与其靶标的结合通常使平衡朝着荧光两性离子移动，从而使此类探针具有荧光性。

然而，大多数罗丹明衍生物，尤其是当其与配体偶联用于细胞靶向时，都以两性离子结构的形式存在，使得其具有较低的细胞渗透性。作者对罗丹明衍生物进行以下方法修饰：

1）在图a中蓝圈部分引入吸电子基团(EWGs)来降低氧杂蒽的电子密度以促进螺内酯形成

2）Y（绿色圆圈）位置表示用来引入EWG来破坏螺内酰胺的形成

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通过将不同的EWG连接到潜在的酰胺上来破坏螺内酰胺的稳定性。具体来说，我们将6-羧基四甲基罗丹明（6-TAMRA，1）一种具有良好光物理性质的荧光团，被分为相应的酰基氰胺（2），酰基磺酰胺（3）和酰基磺酰胺（4和5）。两性离子和螺环形式之间的平衡可以通过d50值来衡量（D50值，定义为两性离子的吸光度比所测得的最高吸光度值降低了一半时候的介电常数，D50值约为50的基于罗丹明的荧光团已被证明是生成荧光探针的合适候选物）图d表明通过改变酰胺上的取代基能调节荧光团的开放形式和封闭形式之间的平衡。

具有细胞渗透性和荧光性的TAMRA衍生物，可用于免冲洗活细胞成像：

SNAP标签融合蛋白可以使用适当的O6-苄基鸟嘌呤衍生物用不同的荧光团特异性标记。在荧光团2-5上修饰O6-苄基鸟嘌呤获得如下探针7-10，在存在和不存在SNAP标签的情况下，对这些探针的光谱特性进行体外表征表明，特别是探针10含有N，N-二甲基磺酰胺基（简称为MaP555-SNAP）在与SNAP标签结合时显示出吸光度和荧光的显着增加。它在非常低的浓度（250nM）下，也能够进行免洗的良好核仁标记成像，在相同条件下用对照探针6标记仅导致几乎检测不到的信号。

同样修饰上卤代烷基链得到相应的基于6-TAMRA探针11-15为Halo Tag（图2E），也运用于基于F-肌动蛋白（SiR-actin）和微管（SiR-微管蛋白）的远红色探针，同样N，N-二甲基磺酰胺基取代基的化合物在活细胞成像实验中表现处出色性，证明合理调节荧光两性离子和疏水性更强的螺内酰胺之间的动态平衡，可以为活细胞生成高度细胞渗透性和荧光探针成像。

将设计策略扩展到了其他常用的罗丹明衍生物，其波长范围从青色到近红外。

综上，作者介绍了一种通用的策略来生成具有出色的细胞渗透性和低非特异性背景信号的荧光探针。使用这种策略，为SNAP标签，HaloTag，F-肌动蛋白和微管创建了波长范围从青色到近红外的探针。这些探针具有良好的光谱特性，高细胞渗透性和出色的荧光性，使其成为活细胞纳米检查的有力工具。此外，可以采用已建立的设计原理的通用性和多功能性来改善许多其他已经存在的荧光探针的性能，并为创造许多新的荧光探针提供了机会。

DOI:10.1038/s41557-019-0371-1