分享一篇发表于JACS上的文章 “Fluorogenic Dimers as Bright Switchable Probes for Enhanced Super-Resolution Imaging of Cell Membranes”。本文的通讯作者是法国斯特拉斯堡大学的Andrey S. Klymchenko教授和加州大学伯克利分校化学系的许可教授。Andrey S. Klymchenko教授团队的研究方向集中在荧光纳米聚合物和分子探针上；许可教授团队研究方向有多维&多功能超分辨显微镜、纳米尺度细胞生物学、石墨烯显微成像及化学研究。

基于单分子定位显微镜（SMLM）的超分辨率荧光成像能够以纳米精度精确地可视化细胞结构。然而，其时空分辨率在很大程度上依赖于ON/OFF可切换荧光染料的亮度。此外，在细胞膜中，膜探针的快速横向扩散阻碍了单分子的定位。在这里，为了解决这两个基本问题，本文提出了一个基于明亮花菁染料荧光二聚体的SMLM（PAINT）概念。探针的末端修饰了低膜亲和力的锚定基团。由于分子内染料H-聚集，它们在水中自猝灭，在与脂质膜的可逆结合后显示出发光。连接体中的带电基团进一步降低了探针对脂质膜的亲和力，从而加速了其动态可逆的ON/OFF开关。这一概念在花菁3和5上得到了验证。活细胞的SMLM结果显示，与参考探针Nile Red和DiD相比，新探针在细胞表面的亮度和扩散速度慢了10倍，将轴向定位精度提高了3倍至31 nm。这种新的探针允许以40秒的时间分辨率观察到活细胞质膜上的纳米级纤维突起，揭示了它们的快速动力学。因此，通过在荧光二聚体中协同猝灭和减缓探针在生物膜中的扩散，可超过单一可切换染料的亮度限制，为显著提高活细胞的超分辨率荧光显微镜开辟新的途径。

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SMLM利用可逆目标结合导致的染料的ON/OFF开关，称为points accumulation for imaging in nanoscale topography (PAINT)。PAINT的关键优点是，它不需要特定的试剂来诱导染料闪烁或复杂的多色激发协议，同时还能提供相对良好的空间和时间分辨率。此外，与其他SMLM技术不同，PAINT使用了一个在溶液中几乎无限的探针库，因此它不受染料光漂白的影响。

质膜的荧光二聚体的设计是基于花菁染料，这些染料容易因H聚集形成而自猝灭，而破坏π堆积会导致它们的荧光发光。两种相同的花菁染料通过一个间隔物连接，而二聚体的末端被带负电荷的锚定基团功能化（图1a）。后者补偿了氰基染料的正电荷，并确保了低亲和力的与细胞质膜的可逆结合。本文首先设计了两种具有不同连接物的探针：(i)用于BTF1的中性酰胺连接物和（ii）用于BTF2的阴离子赖氨酸连接物（图1b）。在两种设计的探针中，选择了5个碳的连接子长度，这因为根据之前对生物分子成像的荧光二聚体的研究，这个长度是获得高效自猝灭H聚集物的最佳长度。连接子的不同是为了调整探针的疏水/亲水平衡，最终直接影响其膜亲和度和ON/OFF周转率。BTF2组有望进一步降低探针对质膜的亲和力，并为探针提供净负电荷。

图1 探针的设计理念及合成路线

接下来，本文对BTF1和BTF2探针的光物理性质进行了表征（图2）。单体Cy3 (I)在PBS中表现出经典的吸收带，与在乙醇和甘油等有机溶剂中类似（图2a）。相比之下，在PBS（pH 7.4）中，BTF1和BTF2的吸收光谱显示出短波长带，具有二聚体染料中H聚集物的特征（图2a）。对于两种探针，短波长和长波长IS / IL的吸光度比值在PBS中为~ 1，在有机溶剂中为0.63 - 0.66，而对于单体Cy3 ( I )，在PBS和有机溶剂中都较低( 0.59 )。说明了BTF1和BTF2在水相中的自淬灭性质。与单体相比，PBS中BTF1和BTF2的荧光强度和相应的量子产率（QY）显著降低，这与溶液中自猝灭聚集体的显著比例一致（图2b,c）。体外模型中，探针BTF1和BTF2随着脂质浓度的增加，荧光逐渐增加，最高可达到1000 nM，且不饱和（图2d）。重要的是，对于亲水性更强的BTF2，这种增长较慢，表明其对脂质膜的亲和力较低。相比之下，Cy3 (I)染料在低浓度DOPC（<50 nM）时荧光强度迅速增加，具有饱和行为，表明与二聚体相比，其对膜的亲和力要高得多。

图2 BTF1和BTF2的光物理性质

鉴于cy3基二聚体在溶剂和脂质囊泡中获得了有希望的结果，文中进一步探索了二聚体设计对红移Cy5染料的适用性。由于光谱数据显示BTF2探针比BTF1具有更好的性能，因此选择了赖氨酸间隔区来开发基于cy5的二聚体BTF3（图1b）。在有机溶剂乙醇和甘油中，BTF3的吸收光谱在650 nm左右达到最大值（图3a），与单体类似物Cy5（III）很接近。相比之下，在PBS中，观察到BTF3有一个特征的短波长吸收带，归于二聚体的H-聚集体。值得注意的是，在这种二聚物中，H-聚集体带的贡献高于Cy3类似物BTF2。与有机溶剂相比，BTF3在PBS中的荧光强度要弱得多（图3b）。在BTF3的磷酸盐缓冲溶液中加入脂质囊泡后，其荧光逐渐增强（图3c），表明该染料与脂质双分子层结合并照亮其荧光。即使在1000 μM时，结合曲线也没有显示出饱和，这表明该二聚体的亲和力仍然相对较低，因此其行为与BTF2相似。表明了本文二聚体的设计可以应用于不同的花菁染料，产生不同颜色的荧光染料。

图3 BTF3的光物理性质

接下来，文中检测了BTF1和BTF2在活细胞的PAINT显微镜中的性能。通过直接把探针加入到细胞中（免洗），即可看到质膜中明显的单分子荧光ON/OFF转换。BTF1和BTF2的成像图较对照的Nile Red显出高亮度、低背景以及形状定义良好的优点（图4a-c）。消光系数BTF2＞BTF1＞Nile Red（图4d-e）。BTF2的ON/OFF事件发生的频率明显高于BTF1（图4d），因为前者对脂质膜的亲和力较低，有利于更快的结合/解结合动力学。此外，对连续帧中探针单分子位移的统计数据显示出显著的差异，扩散系数BTF2~BTF1＜Nile Red（图4f-k）。这种缓慢的扩散可能归因于探针的二聚体结构，分子的长度很高，以开放的形式存在，这可能会使探针在生物膜内的横向运动急剧复杂化。Z轴扫描显示，BTF2和BTF1的图像更清晰（图4l），Z的定位精度分别达到31和44nm（图4m），明显优于参考探针Nile Red（107 nm）。

图4 BTF1和BTF2与尼罗红对比的单分子和3D - PAINT表征

接下来，利用上述高分辨率和对质膜的特异性，本文使用BTF2检测了活COS-7细胞背膜的三维结构。值得注意的是，除了观察膜高度的波动（图5a），还展示了许多薄小管（图5b），垂直截面显示了它们远离细胞表面的突出部分（图5c，d）。此外，通过与活细胞相结合的研究，文中揭示了这些具有亚分钟时间分辨率的纳米尺度小管的快速重塑动力学（图5e）。这些结果表明，质膜远不是一个静态的、各向同性的平板，但在纳米尺度上具有动态的非均匀性。

图5 BTF2的3D - PAINT表征

最后，文中测试了cy5衍生物BTF3，并直接将其与之前用于细胞膜SMLM的基于cy5的参考单体探针DiD进行了比较。与DiD相比，BTF3明显更亮（图6a，b），单分子分析显示，BTF3的光子计数高出70%（图6c）。与DiD相比，BTF3在图像分辨率方面具有明显的优势（图6d，e）。在COS-7细胞质膜的更好分辨率图像中，可以观察到不同的纳米结构（图6e），与探针BTF2显示的结构相似（图5b）。BTF3Z轴精度为31 nm，与BTF2相似，比DiD要好得多（117 nm，图6f−i）。单分子位移分析显示，BTF3的扩散系数非常低，为0.17μm2/s（图6j）。这一结果证实了本文基于二聚体的设计抑制了染料在膜上的扩散，并确保了BTF3在质膜的超分辨率成像中有更好的性能。

图6 BTF3和DiD的单分子和3D - PAINT表征

总之，这项工作解决了用于细胞膜超分辨率（SMLM PAINT）显微镜下的荧光染料的基本缺点：低亮度和在生物膜中的快速横向扩散。本文设计了荧光二聚体，在细胞膜上进行明亮的荧光团的可逆ON/OFF转换。荧光二聚体的概念有两个关键的优势：(i)两个荧光团提供更高的单分子亮度，（ii）二聚体设计在膜上提供更慢的扩散，这抑制了单分子成像中的运动模糊效应。总的来说，本文的工作表明，利用多聚染料中的协同去猝灭现象，打开了超越单个荧光团的亮度限制的道路。此外，控制染料在生物膜中的扩散也是进一步提高超分辨率成像性能的关键因素。