分享一篇发表在JACS上的文章，通讯作者是来自新加坡南洋理工大学生物科学学院的James P. Tam教授和Chuan-Fa Liu教授。Tam教授主要从事活性肽的设计、化学酶促连接反应、半胱氨酸肽的合成及折叠等方面的研究。Chuan-Fa Liu教授主要关注肽和蛋白质的功能设计应用以及基于肽和蛋白质的药物开发。
天冬酰胺内肽酶AEP是一种半胱氨酸蛋白酶，其可以催化天冬氨酸（Asp）肽或者天冬酰胺（Asn）肽键的水解，也可作为连接酶催化转肽反应或者肽环化。其机理是，利用半胱氨酸巯基来攻击底物的Asp/Asn，导致酰基酶硫酯中间体形成及水解，最后在目标肽N端形成Asn-Xaa肽键。pH在AEP催化上起着关键作用，pH增加后，由于P1-Asp的羧基失去氢键供体而减弱和底物的结合，Asp水解活性降低。然而，Asn在高pH下也能结合氢，所以在较宽pH下AEP和Asn肽底物均可以结合并保持活性。此外，连接酶活性也随着pH增加而增加。虽然pH和底物的构象影响了AEP的催化活性，但在双重活性的AEP家族中，有一些完全作为连接酶存在（PAL），且几乎所有的PAL都是基于P1-Asn连接。基于此，本文中，作者发现一些已知的高效天然PAL（VyPAL2、butelase-1 和 OaAEP1b），其可以在酸性pH下催化Asp肽键的肽环化及分子间连接，虽然速率低于Asn连接但比Sortease A更快。而Asp-Xaa在中碱性pH的稳定性也允许第二次的Asn连接反应发生，实现pH控制的正交连接。
PAL识别酰基供体的Asx-P1'-P2'，而此前研究表明P2'上Leu有利于中间体生成，所以作者合成了一组带有C端DXL、N端GI基序的P1'-Asp肽，使用不同PAL进行环化反应。结果显示，VyPAL2对P1'上的丝氨酸有偏好性，而butelase-1整体环化活性较低，OaAEP1b整体环化活性较高。因此，作者研究了VyPAL2对P1'-Asp底物-DSL和已知P2'-Asn底物-NGL的动力学，发现-DSL肽的最佳环化pH为4.5，而在pH7.4时酶对-NGL的环化活性比对-DSL的高1000倍以上，这种差异使得Asp存在下的Asn正交连接成为可能。在对另外两种酶也进行肽上的pH偏好性实验后，他们发现VyPAL2能够更好的实现pH控制下的串联Asp-Asn连接。
接下来，作者用模型蛋白sfGFP证明了低pH下能够VyPAL2实现单独的Asp的环化和C端标记。结果显示，VyPAL2催化速度比sortase A更快，说明PAL介导的Asp连接是实用的蛋白质修饰方法。之后，他们证明了VyPAL2能够在N端GV、C端-NSL的工程化sfGFP上执行pH控制下的N端到C端的串联连接，即先在pH4.5时在N端上连接P1-Asp肽并纯化后，再在pH7.4时在蛋白带有P1-Asn的C端连接上Dox-peptide，每次连接都有50%以上的产率。在One-Pot串联连接中，先在pH4.5下完成N端连接，后迅速调节pH到7.4，最终能以45%产率获得终产物。这说明N端到C端的串联标记是成功的。随后的实验中，作者也在EGFR Affibody实现了C端到N端的串联标记，并且在分别使用OaAEP1b/butlease-1或者OaAEP1b/VyPAL2进行组合连接时都有高效和高特异性，而带有荧光缀合物的Affibody也可以发挥正常的亲和作用。这些结果说明PAL酶能够实现pH调节的蛋白正交连接。
总之，作者发现PAL能够在pH控制下完成对P1-Asn/Asp底物的高效高特异性串联标记，且能够双向进行来构建双重标记缀合物。文章链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.1c02638原文引用：DOI：https://doi.org/10.1021/jacs.1c02638
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