分享一篇发表在Journal of the American Chemical Society 上的文章“Alkaline Phosphatase-Controllable and Red Light-Activated RNA Modification Approach for Precise Tumor Suppression”。

RNA干扰（RNAi）已被证明是一种有前途的治疗方式。但是，传统RNA疗法的临床应用前景由于低传递效率和RNA对血清RNA酶的敏感性而严重受阻。因此，开发先进的RNAi技术是实现精准医疗日益增长的需求。在这里，作者设计合成了一种ALP敏感的近红外荧光探针f-RCP，在红光照射下可以释放产生单线态氧的能力，从而引发细胞内RNA分子呋喃与碱基的共价环化反应，导致肿瘤细胞线粒体明显损伤和严重凋亡，从而实现有效的肿瘤抑制。

作者通过化学合成的方法合成了荧光探针f-RCP以及对照探针RCP（不含呋喃基团）。接着开始对ALP酶反应性的体外研究。通过HPLC监测确定f-RCP在Tris缓冲液中具有很高的稳定性。在与ALP孵育后，测定最大吸收和最大发射分别是685 nm和710nm。接下来，作者进一步评估了f-RCP对ALP的检测灵敏度。荧光强度随着ALP的增加而逐渐增强，并且ALP的检出限为0.061 U/L⁻¹。这些结果表明探针可用于ALP酶的特异性和灵敏检测。

作者使用DPBF评估ALP酶孵育前后探针的¹O₂生成能力。结果证明f-RCP的¹O₂生成能力可以被ALP激活，并且单线态氧传感器的测量也证明了这一点，这表明f-RCP有潜力作为ALP激活的光敏剂。接着评估¹O₂是否能够在水溶液中启动探针与RNA分子碱基之间的共价环化反应，将f-RCP与ALP酶孵育1小时后加入模型RNA分子，然后暴露在660 nm激光下。RNA凝胶电泳看出，只有RNA条带显示出荧。说明在ALP和红光的调控下，f-RCP可以成功修饰RNA分子，并且f-RCP探针优先与RNA而非DNA发生反应。

接着验证探针在活细胞中的反应性以及光动力效应，共聚焦成像显示f-RCP可以检测ALP，且在ALP和红光照射下可以生成¹O₂。受上述结果启发，作者进一步评估了f-RCP在活细胞中的ALARM效应。将HepG2细胞分别与f-RCP和RCP孵育，再用激光照射。结果显示，f-RCP+660 nm的细胞荧光最亮，且与RNA染色有较大重叠。亚细胞定位结果显示，f-RCP大部分聚集在细胞线粒体中。用RNA提取试剂盒提取上述不同组合的RNA进行荧光扫描，只有f-RCP+660 nm的细胞RNA有荧光信号。同时进行RNA凝胶电泳。正如预期一样，只有f-RCP +660 nm组的RNA检测到荧光带。这些发现证明f-RCP可以共价修饰肿瘤细胞的胞内RNA。在ALP和红光介导的细胞内RNA共价修饰下，ALARM方法可以延长探针在癌细胞中的停留时间。

作者推测被探针修饰的RNA分子结构可能被破坏，从而导致细胞功能障碍。为了验证其假设，首先证明了f-RCP和RCP对癌细胞和正常细胞的细胞毒性均可忽略不计。在660 nm的照射下，f-RCP处理的细胞出现了严重的细胞死亡，而RCP+660 nm处理的细胞几乎很少。接下来研究细胞的线粒体功能是否被破坏。用JC-1染料评估了线粒体膜电位变化，对照组细胞的线粒体保持良好的完整性，f-RCP+660 nm细胞中的线粒体膜发生了严重的损失。在细胞ATP水平的变化中，与对照细胞相比，f-RCP+660 nm细胞的ATP水平明显下降。用透射电镜观察后发现f-RCP+660 nm处理的细胞线粒体微观结构明确显示出可区分的形态变化，如外膜破裂和严重肿胀。这些结果支持了探针对线粒体RNA的共价修饰可以诱导线粒体损伤，从而导致严重的细胞凋亡。

在遗传水平上，作者对f-RCP+660 nm处理的HepG2细胞和RCP+660 nm处理的HepG2细胞进行RNA测序，来评估其基因表达谱。发现f-RCP+660 nm细胞与RCP+660 nm组有913个基因差异。分析显示，不同表达的基因大多富集在细胞缺氧反应、凋亡和线粒体膜电位负调控的生物过程中，这进一步证实了之前的发现。此外，差异表达最多的基因主要参与癌、P53等信号通路，而且这些差异基因大多参与凋亡相关的功能通路。这可能是ALARM诱导肿瘤细胞凋亡的主要原因。

最终作者研究f-RCP在体内的抗肿瘤效果。首先注射HepG2细胞构建荷瘤小鼠模型，接着静脉注射f-RCP和RCP，在注射4 h后用660 nm激光照射不同时间，观察抗肿瘤疗效。结果显示所有对照肿瘤均快速增长，而f-RCP+660 nm组的小鼠肿瘤生长受到抑制。此外，48h后切除肿瘤组织进行H&E染色。对照组肿瘤切片均未见明显恶性坏死，f-RCP+660nm组肿瘤出现严重坏死。TUNEL和anti-caspase-3免疫荧光分析再次验证了这一点。这些证据表明f-RCP的良好抗肿瘤作用。

总之，作者合成了一种具有RNA修饰特征的新型肿瘤靶向和ALP响应的荧光探针f-RCP。体外和体内实验结果均证明f-RCP具有良好的肿瘤靶向能力和对内源性ALP酶的良好反应性。且在ALP的裂解和红光照射下，f-RCP与细胞质RNA发生共价环化反应，导致癌细胞严重凋亡，最终有效抑制肿瘤。

本文作者：WHF

责任编辑：FJY

DOI：10.1021/jacs.2c10409

原文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.2c10409