分享一篇发表在JACS的文章Alkaline Phosphatase-Controllable and Red Light-Activated RNA Modification Approach for Precise Tumor Suppression。通讯作者是来自苏州大学放射医学与辐射防护国家重点实验室的史海斌教授。
RNA干扰是一种有前景的疾病治疗方式。然而，传统的RNA疗法在临床应用中受到递送效率低、易被血清RNase降解的限制。在此，作者首次提出了一种碱性磷酸酶（ALP）和红光双重调控的RNA修饰方法（ALARM），用于近红外（NIR）和光声（PA）双模式肿瘤成像和治疗。该研究设计合成了一种ALP酶响应的近红外荧光探针f-RCP，主要由3部分构成：（1）环肽c-RGD，用于靶向肿瘤细胞膜过表达的整合素受体ανβ3，（2）ALP激活的荧光团CyOP，作为光敏剂，（3）对单线态氧（1O2）敏感的呋喃单元，用于RNA修饰（图1）。研究表明，f-RCP探针可以特异性靶向肝癌HepG2细胞，并在被ALP酶裂解后产生激活的近红外和光声信号，从而可以对高表达ALP酶的肿瘤细胞进行高灵敏成像。同时，探针可以在红光照射下产生1O2，可引发探针通过呋喃基团共价修饰到肿瘤细胞内RNA分子的碱基上，导致线粒体损伤，并诱导严重的细胞凋亡，从而实现对肿瘤的有效抑制。此外，本研究还在转录组水平上对其诱导细胞凋亡的机制进行了探究。图1. ALP和红光双重调控的RNA修饰，用于体内NIR/PA双模式肿瘤成像和治疗。首先，作者对f-RCP探针进行了合成和表征，并评估了探针对ALP酶的反应性，结果表明，探针对ALP酶的检测具有特异性和灵敏度（图2a-d）。受f-RCP探针被ALP酶裂解后的吸收值可红移至685 nm这一特点的启发，作者推测f-RCP应该能够发出PA信号。通过验证表明，f-RCP探针确实可以作为PA成像的造影剂（图2e、2f）。接下来，作者在体外评估了f-RCP探针对RNA分子的ALARM行为。ALP酶可以激活f-RCP探针产生1O2（图3a、3b）。单线态氧1O2可以在水溶液中启动探针和RNA分子碱基之间的共价环化反应，揭示了RNA分子可以在ALP酶和660 nm红光的双重调控下被f-RCP成功修饰（图3c、3d）。作者进一步测试了f-RCP探针在高表达ALP酶的肝癌细胞HepG2中产生1O2的能力。如图3e所示，在f-RCP和660nm激光的处理下，明显观察到亮绿色荧光，表明存在大量的1O2。随后，作者评估了f-RCP探针在活细胞中的ALARM行为。如图3f所示，f-RCP+660 nm处理的细胞，显示出明显的探针红色荧光和RNA染色重叠，表明在660 nm照射下，f-RCP可以特异性标记高表达ALP的癌细胞中的内源性RNA。随后，作者进一步确认了探针与细胞内RNA的特异性结合，f-RCP和细胞内RNA之间有良好的共定位（图3g）。提取不同处理组的细胞中的RNA，进行荧光扫描，仅在f-RCP + 660 nm处理的细胞RNA中检测到强烈的荧光信号（图3h）。同时，进一步提取细胞质和细胞核中的RNA，分别进行RNA凝胶电泳。正如预期的那样，只在f-RCP + 660 nm处理的细胞质RNA中观察到明显的荧光条带（图3i），所有组的细胞核RNA都没有检测到荧光，表明f-RCP有效结合在细胞质RNA上。图3. 体外评估探针f-RCP对RNA分子的ALARM行为。随后，作者证明了ALARM策略能够特异性、有效的延长探针在高表达ALP的癌细胞中的保留时间（图4a、4b）。紧接着，作者在小鼠体内进行了肿瘤成像（图4c）。与图4a的细胞成像数据相似，f-RCP + 660 nm处理的肿瘤显示出明显较慢的荧光下降（图4d）。图4e中的定量数据表明，f-RCP + 660 nm处理的肿瘤即使在36 h后仍保留15.1%的初始探针，而所有对照组的肿瘤都低于4%。此外，图4f、4g中的PA成像结果显示，探针能够对体内肿瘤进行高灵敏成像。上述结果表明，ALARM策略可以明显地延长f-RCP探针在细胞中的保留时间，从而对高表达ALP的肿瘤进行高灵敏的长时间成像。作者推测，被探针共价修饰的RNA分子，其结构可能被严重破坏，这可能导致细胞功能障碍。为了验证该假设，先后通过MTT和细胞染色评估不同组合处理的细胞凋亡水平，其中，f-RCP+660 nm处理的实验组中观察到了明显的细胞凋亡，证明ALARM策略可以选择性的诱导癌细胞凋亡（图5a、5b）。由于上述研究证明f-RCP主要位于细胞线粒体中，作者分别通过检测线粒体膜电位、监测细胞ATP水平以及通过TEM观察HepG2细胞的形态学变化，来探究细胞中的线粒体功能是否会受到影响（图5c、5d、5e）。实验结果表明，f-RCP探针对线粒体RNA的共价修饰会诱发线粒体损伤，从而导致严重的细胞凋亡。作者通过RNA-seq，在转录组水平上对ALARM介导的细胞凋亡机制进行了探究。f-RCP + 660 nm处理的细胞共鉴定了15443个基因，其中913个基因与RCP + 660 nm处理组的基因不同（图6a）。基因本体（GO）分析显示，不同的基因大多富集在细胞对缺氧的反应、细胞凋亡和线粒体膜电位的负调控等生物过程中（图6b），这进一步证实了之前的发现，即探针对细胞质RNA的共价修饰可能导致线粒体损伤以及细胞凋亡。差异表达的基因主要涉及癌细胞、P53、MAPK、TNF等信号通路（图6c）。图6d显示，这些差异基因大部分都参与了与细胞凋亡相关的信号通路。此外，图6e的热图分析表明，与RCP+660 nm的对照组相比，f-RCP+660 nm处理的细胞上调和下调的基因数量分别为19和29。大部分上调的基因被发现与细胞凋亡高度相关，这可能是ALARM诱导肿瘤细胞凋亡的主要原因。图6. 对HepG2细胞进行两种不同处理的转录组分析。最后，作者评估了在ALP酶和红光的双重作用下，f-RCP在体内的抗肿瘤效果。将HepG2细胞注射到BALB/c裸鼠背部的左右两侧，建立了双侧肿瘤小鼠模型（图7a）。如图7b-d所示，所有的对照组的肿瘤都呈现出类似的快速增长趋势，表明肿瘤抑制效果较弱。然而，与RCP + 660 nm组相比，实验组f-RCP + 660 nm（第6组）的小鼠肿瘤生长受到明显抑制。此外，TUNEL和anti-caspase-3免疫荧光分析再次表明，f-RCP +660 nm处理的肿瘤组织表现出最严重的DNA损伤和细胞凋亡（图7e）。这些证据表明，在ALP酶和红光的作用下，f-RCP探针在体内具有出色的抗肿瘤效果。总之，该研究开发了一种ALP酶和红光双重调控的肿瘤RNA化学修饰的新方法，并阐明了其诱导细胞凋亡的机制，为开展肿瘤精准治疗研究提供了新思路。https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.2c10409原文引用：10.1021/jacs.2c10409
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