为大家分享一篇发表在JACS上的文章，题目为Ultrafast Bioorthogonal Spin-Labeling and Distance Measurements in Mammalian Cells Using Small, Genetically Encoded Tetrazine Amino Acids。本文共两位通讯作者，分别为华盛顿大学的助理教授Stefan Stoll和俄勒冈州立大学的教授Ryan A. Mehl。Stoll课题组主要基于双电子自旋共振（double electron-electron resonance, DEER）技术研究蛋白构象的动态变化，Mehl课题组主要发展遗传密码子拓展（Genetic code expansion, GCE）技术。
蛋白质在发挥生命功能的过程中往往伴随着结构的动态变化，然而，在细胞内对上述结构变化进行直接研究的技术仍然比较匮乏。近期，研究人员利用定点自旋标记（Site-directed spin-labeling, SDSL），在大分子的选定位点引入自旋标记，随后基于双电子自旋共振（double electron-electron resonance, DEER）技术，测量磁偶极之间距离依赖的相互作用，即可获得生物大分子的构象信息。与FRET相比，DEER技术中自旋标记的体积通常比荧光探针小，并且DEER测定的距离受其他因素的干扰少。
目前，研究人员主要通过GCE技术向细胞内的特定蛋白质中引入自旋标记。考虑到自旋标记半衰期较短，先插入UAA，随后基于生物正交反应引入自旋标记是目前主流的标记策略。上述过程中使用的生物正交反应，往往要求具有迅速的反应动力学、严格的生物正交性，以及较短的连接子长度。环张力驱动的逆电子需求DA反应（strain-promoted IEDDA）能够满足上述反应要求，然而，已开发出的含有四嗪基团的UAA往往具有较长的连接子，因此，研究人员设计并合成出下一代UAA，即Tet-v4.0Me/Ph/Pyr，并基于相同考虑，设计了三种不同的氮氧自由基-TCO分子。
研究人员从Mb Pyl-tRNA/RS出发，经两轮正向和反向筛选后，得到E1、D4两个合成酶突变体，实现Tet-v4.0Ph/Pyr的特异性插入。
随后，研究人员证实不同sTCO分子与插入Tet-v4.0Ph的GFP蛋白之间仍保持该生物正交反应超高的反应速率，其二级反应速率常数达105 M-1·s-1。由此推算，在亚μM级的标记探针浓度下，自旋标记反应可以在数分钟内反应完全。
随后，研究人员选择麦芽糖结合蛋白（MBP）作为模型蛋白，构建了两个自旋标记位点对，211/295与278/322，并探究本文发展的自旋标记技术与传统Cys-MTSL标记技术之间的优劣。结果表明，在纯化的蛋白模型上，基于Tet-v4.0Ph和sTCO-tE5的标记方法能够有效反应MBP的构象，以及麦芽糖结合前后的构象变化。在对四嗪UAA的反应性、sTCO-自旋标记探针的细胞通透性以及反应进程进行探究后，研究人员成功建立了在HEK293T细胞中原位引入自旋标记的实验流程，并用其表征GFP、MBP-W340A突变体的构象，取得了和体外纯化蛋白相同的实验结果，初步证实基于SDSL和DEER技术对细胞内蛋白的动态构象进行直接研究的可能性。综上所述，本文发展了新一代四嗪UAA Tet-v4.0，基于定点自旋标记和双电子自旋共振技术，实现了对细胞内蛋白动态构象的直接研究。原文链接：https://doi.org/10.1021/jacs.3c00967原文引用：10.1021/jacs.3c00967
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