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分享一篇发表在Nature Communications上的文章，题目为“A proximity biotinylation-based approach to identify protein-E3 ligase interactions induced by PROTACs and molecular glues”。本文作者开发了一个基于AirID的邻近依赖性生物素化的工作流程，以确定药物诱导的E3连接酶cereblon（CRBN）的新底物。使用AirID-CRBN，他们在体外检测了CRBN新底物的IMiD依赖性生物素化，并以高特异性和选择性的质谱法鉴定知名新底物的生物素化多肽。其他分析显示ZMYM2和ZMYM2-FGFR1融合蛋白是CRBN的新底物，负责8p11综合征涉及急性骨髓性白血病。此外，AirID-DCAF15和AirID-CRBN分别对吲哚磺胺和PROTACs靶向的新底物进行生物素化，这表明这种方法有可能成为描述细胞中药物诱导的蛋白-蛋白相互作用的一般策略。
沙利度胺最初被用作一种镇静剂，但据报道它有严重的致畸作用。目前，沙利度胺及其衍生物（免疫调节药物；IMiDs)，包括来那度胺、泊马度胺和5-羟基沙利度胺（5HT，图1a）；来那度胺和泊马度胺是用于治疗某些血液癌的主要药物。IMiDs直接与cereblon（CRBN）相互作用，招募CRL4CRBN的关键底物（称为新底物），随后促进26S蛋白酶体对新底物的降解。由于IMiDs的主要作用是促进CRBN和新底物蛋白之间的相互作用，因此分析IMiDs诱导的蛋白-蛋白相互作用（PPIs）对于理解IMiDs的生物学作用至关重要。如图1b所示，他们最近报道了AirID融合的CRBN（AirID-CRBN）可以依赖IMiDs生物素化IMiDs的新底物IKZF1和SALL4。接下来，他们通过慢病毒感染CRBN−/−HEK293T细胞，获得稳定表达AGIA-AirID-CRBN-WT（野生型）或-YW/AA的重组细胞系，并使用瞬时转染Myc-SALL4和Myc-IKZF1表达载体的重组HEK293T细胞进行STA-PDA检测。免疫印迹分析显示，AGIA-AirID-CRBN-WT在波马利度胺存在下同时生物素化了Myc-SALL4和Myc-IKZF1，而AGIA-AirIDCRBN-YW/AA没有（图1c）。然后他们产生了一个稳定表达AGIA-AirID-CRBN的多发性骨髓瘤细胞系MM1.S，并比较了两种常规方法（链霉菌素或抗生物素抗体）和塔马维丁 2-REV对生物素化蛋白质或肽的富集情况。LC-MS/MS分析显示，在三种富集方法中，塔马维丁 2-REV富集使我们能够检测到大多数生物素化的新底物的肽，如IKZF1、IKZF3和ZFP91(图1d）。此外，他们还报告，沙利度胺的主要代谢物5HT不能诱导IKZF1和IKZF3蛋白降解。基于这些发现，他们研究了AirID-CRBN的生物素化是否为每个IMiDs处理提供了新底物选择性。STA-PDA显示，在MM1.S细胞中，5HT很少诱导AirID-CRBN诱导IKZF1和IKZF3的生物素化（图1e）。与STA-PDA和之前的研究一致，生物素化肽的LC-MS/MS分析表明，来那度胺和泊马度胺能强烈诱导IKZF1和IKZF3的生物素化，而沙利度胺和5HT几乎不能诱导生物素化(图1f）。从质谱数据中提取的热图分析清楚地显示了药物对IKZF1和IKZF3的药物选择性（图1g）。 图1 细胞中存在沙利度胺和IMiDs时AirID-CRBN生物素化新底物
接下来他们验证BioID-CRBN、TurboID和AirID酶对药物诱导的生物素化。因为已经有研究表明，AirID-CRBN和tamavidin2-REV的结合可以识别新底物，他们接下来比较了AirID与BioID（BirA*）和TurboID42，这两种酶都是传统的邻近依赖的生物素化酶。首先，他们生成了稳定表达BioID-CRBN的HEK293T和IMR32细胞，并研究了BioID-CRBN是否可以依赖于Imids的生物素化新底物。在以前的报告中，BioID酶需要长时间的标记时间和高浓度的生物素来实现相互作用蛋白的生物素化。与这些报告相一致的是，用生物素和泊马度胺孵育6小时并不足以进行新底物的生物素化（图2a、b）。其次，他们生成了稳定表达TurboID-CRBN的HEK293T和IMR32细胞，并比较了AirID-CRBN和TurboID-CRBN之间Imids依赖的新底物生物素化。在STA-PD的免疫印迹分析中，AirIDCRBN在添加泊马度胺和生物素2和6小时后，生物素化ZMYM2、ZNF687和PLZF（图2c，d）。相比之下，在补充泊马度胺和生物素2小时后，TurboID-CRBN Imids依赖于生物素化的ZNF687和PLZF，而不是ZMYM2（图2c，d）当添加泊马度胺和生物素6小时后，在表达TurboID-CRBN的细胞中强烈观察到泊马度胺独立的生物素化（图2c，d）。为了全面比较AirID-CRBN和TurboID-CRBN之间新底物依赖Imids的生物素化，我们在短暂标记条件下使用表达AirID-CRBN或TurboID-CRBN的IMR32细胞对tamavidin2-REV富集后进行了LC-MS/MS分析。虽然鉴定的生物素化蛋白几乎有一半是相同的，但另一半是不同的(图2e）。然而，仅在表达AirID-CRBN的细胞中观察到ZMYM2的泊马度胺依赖性生物素化，而ZFP91和ZNF827的生物素化仅在表达TurboID-CRBN的细胞中观察到(图2f）。
图2 新底物生物素化过程中生物素化酶的比较 最后他们验证AirID融合方法可应用于分子胶和PROTACs。吲哚磺胺是一种芳基磺胺类药物（图3a），对几种人类细胞类型具有抗癌作用，是哺乳动物中的第二类分子胶降解剂，并通过与DCAF15 (DDB1-和CUL4相关因子15相互作用，降解RNA结合蛋白39（RBM39）来发挥抗癌作用据报道，DCAF15- BioID生物素化RBM39在K562细胞中处理72 h。AirID-CRBN以更短的标记时间化新底物，因此，他们研究了AirID方法是否可以应用于分离（图3b）。首先，我们通过慢病毒感染生成了稳定表达AGIA-AirID-DCAF15-WT或-D475N（与不结合突变体）的HCT116细胞。STA-PDA和免疫印迹分析显示，AGIA-AirID-DCAF15-WT以不稳定依赖的方式生物素化内源性RBM39，而AGIA-AirID-DCAF15-D264N没有（图3c）。此外，对生物素化肽的LC-MS/MS分析显示，在HCT116细胞中，RBM39被显著的生物素化(图3d）。这些结果表明，AirID融合E3连接酶可以应用于分子胶的研究。 PROTACs是由两种功能化合物合成的药物：一种E3连接酶结合剂和一种目标结合物。许多基于Imids的PROTACs已经被开发用于治疗，因为它们的高药物作用，可诱导靶蛋白的彻底降解。然而，基于IMiDs的PROTACs不仅诱导靶蛋白的降解，还诱导IMiDs的新底物的降解，这为其应用提出了一个大问题。以BRD4和泊马度胺为基础的PROTACs（分别为dBET1和ARV-825；图3e）诱导了新底物如IKZF1、IKZF3和SALL4的蛋白质降解。他们尝试联合使用AirID-CRBN和生物非依赖性LC-MS/MS分析来进行PROTACs验证。STAPDA结果表明，AirID-CRBN可以通过dBET1或ARV-825处理使MM1.S细胞中的BRD4、IKZF1和IKZF3发生生物素化（图3f）。PROTACs的剂量对于产生有效的效果是非常重要的。因此，他们首先检测了PROTACs的适当治疗时间和剂量，以实现AirIDCRBN对BRD4的有效生物素化。STA-PDA显示，高剂量的PROTACs和长时间的处理可诱导IKZF1和IKZF3的生物素化，而不是BRD4（图3g）。基于这些结果，他们确定在0.1µM ARV-825和5µM生物素下处理6小时是最佳的。然后，他们使用DMSO、泊马度胺或ARV-825进行了生物素依赖性的LC-MS/MS分析。在ARV-825处理的BRD2中检测到BRD2、BRD3和BRD4的生物素化肽，但在DMSO或泊马度胺处理的裂解液中没有检测到(图7h）。这些结果表明，AirID系统可应用于对药物诱导的PPIs进行分析的PROTACs的研究。 图3 AirID可应用于其他分子胶和PROTACs 总结来说，蛋白质水解靶向嵌合体(PROTACs)和分子胶，如免疫调节药物（IMiD）和吲哚磺胺是诱导底物蛋白和E3泛素连接酶之间相互作用的药物，以实现目标蛋白降解。本文中开发的AirID融合方法是理解药物诱导的相互作用组的一种可靠的方法。 本文作者：FC 责任编辑：FC DOI: 10.1038/s41467-021-27818-z 原文链接：https://doi.org/10.1038/s41467-021-27818-z
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