2022年10月21日，韩国首尔大学的Hyun-Woo Rhee副教授课题组在Cell Chemical Biology上发表了一篇将邻近标记系统TurboID与标签蛋白Halo tag联用来鉴定小分子靶蛋白的文章。其标题为“Identification of proteomic landscape of drug-binding proteins in live cells by proximity-dependent target ID”.（原文链接：https://doi.org/10.1016/j.chembiol.2022.10.001）。

小分子药物是治疗疾病的重要手段，它们通过与体内靶点互作从而调控疾病进程，阐明小分子药物与靶点（通常是蛋白质）的相互作用对于人们理解小分子药物的作用机理和相关疾病的发展过程至关重要。除此之外，揭示小分子的脱靶效应可以帮助大家理解和避免其潜在的毒副作用[1]，同时推动小分子药物的结构优化，获得药效更高、副作用更小的药物，甚至可以实现老药新用，使得药物价值得到最大化利用。

虽然鉴定小分子药物的互作蛋白非常重要，但目前有效的手段却极为有限。大家常用的方法主要包括直接和间接两类。直接法主要是通过构建合适的小分子亲和探针来钓取对应的靶点，其中Activity-based protein profiling (ABPP) 这种基于活性的靶点鉴定技术得到了很好的发展和利用[2]，它可以将小分子亲和探针共价修饰到靶点蛋白上，使得潜在的靶蛋白不至于在严苛的洗脱和处理环境下丢失。广受好评的探针策略需要对小分子进行合适的化学修饰或改造，但这一过程这一费时费力且不一定可行。一系列通过测定小分子与蛋白结合时物理化学性质改变的间接方法也被开发出来，例如CETSA技术利用小分子和蛋白结合时的热稳定性来鉴定潜在的靶蛋白[3]，但是由于这些间接方法重复性低，结果难以分析，目前并没有被广泛使用，而是常常被作为“备选”方案来验证其他方法获得的靶蛋白是否可靠。

由于邻近标记技术（Proximity labeling）已经在蛋白-蛋白互作和蛋白-核酸互作领域[4]得到了充分地开发利用，但如何将邻近标记技术引入蛋白-小分子互作领域确是一个挑战。由于邻近标记酶需要通过和其他蛋白融合表达来捕获潜在的互作分子，而将其和小分子“融合”到一起显然不现实。2016年，Wells课题组通过利用“衔接蛋白”解决了这一问题[5]，这类衔接蛋白工作的原理非常简单，它们可以高效且特异地与底物分子共价交联到一起。这种衔接蛋白可以和邻近标记酶共表达，从而与小分子拼接到一起，使得和小分子亲和邻近的潜在靶蛋白被邻近标记系统捕获，最后可以被方便地富集和分析。但是Wells课题组构建的系统只能在体外进行实验，而如何实现在体内邻近捕获与小分子互作的靶蛋白，获得生理条件下有价值的靶点信息尤为重要。本文作者通过结合邻近标记技术TurboID无偏标记和Halo tag高效结合氯代烷基配体的优点，开发出基于邻近标记系统的小分子靶点鉴定技术Proximity-based compound-binding protein identification（PROCID）来直接分析捕获的生物素化肽段，并利用了一些经典药物验证了该技术的有效性。

图1 基于邻近标记系统的小分子靶点鉴定技术

作者首先进行系统构建，在细胞内构建了TurboID和Halo tag共表达体系之后就是选择使用何种药物进行验证。作者选择了达沙替尼这一得到充分开发的慢性白血病药物，并合成了带有不同linker长度的达沙替尼探针，表型的实验表明合成的两个探针DA3和DA5可以有效地抑制癌细胞K562的生长。为了检测达沙替尼探针能否有效结合到Halo tag系统上，作者将其与另一种荧光探针进行竞争性实验，结果显示达沙替尼探针浓度越高，游离的荧光信号越高，表明达沙替尼探针以剂量依赖的形式有效地和Halo tag结合。综上，作者成功地构建了PROCID系统，并可以在生理条件下鉴定达沙替尼的药物作用靶点。

图2 两种达沙替尼探针均可有效抑制癌细胞K562生长

图3 达沙替尼探针以剂量依赖的形式有效地与Halo tag系统结合

进一步地，作者对达沙替尼的已知靶点进行了验证，达沙替尼被FDA批准作为ABL1激酶的抑制剂。作者首先验证这一靶点能够有效被PROCID系统邻近生物素化，通过在293T细胞中共表达PROCID系统和ABL1激酶蛋白，结果表明，仅有在添加达沙替尼探针的条件下，ABL1才显示被生物素化，这说明ABL1不是被随意生物素化的，而是与达沙替尼探针亲和并与TurboID邻近而被生物素化。作者想要直接看到ABL1与达沙替尼探针亲和互作的信息，并由此将PROCID系统添加了一个线粒体膜锚定域MoA，使得PROCID系统被固定到线粒体外膜上，而ABL1则弥散地分布在细胞质中，作者观察到当添加了达沙替尼探针后，ABL1蛋白显著地被富集到线粒体周围，这表明其确实与达沙替尼探针发生了相互作用，从而从细胞质转位到线粒体外膜周围。综上表明了PROCID用于鉴定达沙替尼互作蛋白的有效性。

图4 添加达沙替尼探针条件下ABL1被生物素化

图5 添加达沙替尼探针条件下ABL1被转位至线粒体外膜

由于已经验证得到了有效的PROCID系统，作者进一步地想要探究其他潜在的达沙替尼互作蛋白，将质谱鉴定得到的靶蛋白进行分析后，发现了34个达沙替尼相互作用蛋白，主要可以分为两类，包括酪氨酸激酶ABL1、ABL2、BTK和CSK，以及ATP结合蛋白RIOK1和SMARCA2。其中，由于ABL1/2已经是FDA批准的靶点，无需进一步验证，其他两种激酶BTK和CSK虽然已有体外亲和力实验验证，但是还没有体内生理状态下的实验验证表明它们与达沙替尼的相互作用。作者沿用之前的方法，成功证明了BTK和CSK可以被达沙替尼探针诱导邻近生物素化并且被有效转位至线粒体外膜周围，这初步表明了BTK和CSK是达沙替尼潜在的生理靶点。

图6 BTK和CSK可与达沙替尼探针互作并被邻近标记酶生物素化

图7 BTK和CSK可与达沙替尼探针互作并转位至线粒体外膜周围

在验证了达沙替尼的体内互作蛋白之后，作者希望进一步探究达沙替尼的新靶点SMARCA2，这是一种ATP结合蛋白，参与染色质重塑过程。实验结果表明，SMARCA2生物素化的位点与其ATP结合位点非常邻近，所以作者推测达沙替尼是结合到SMARCA2的ATP结合域。为了验证这一猜想，作者首先获得了SMARCA2在Alphafold数据库中的预测结构，并将达沙替尼与这一预测结构进行分子对接，发现对接的位点与PDB数据库中已知的ATP- SMARCA2结合位点高度重叠，这进一步表明达沙替尼极有可能是通过与ATP结合域结合来调控SMARCA2靶蛋白。

为了精确验证，作者设计了一个邻近连接分析实验（Proximity ligation assay），利用SMARCA2的ATP结合域（^ABDSMARCA2）和PROCID系统，观察^ABDSMARCA2是否在达沙替尼探针存在的情况下与TurboID邻近，经过PLA实验验证，表明^ABDSMARCA2确实经达沙替尼探针诱导与TurboID邻近，并产生显著的荧光信号。这充分验证了达沙替尼是通过与^ABDSMARCA2互作来调控靶蛋白，也进一步证实了SMARCA2是达沙替尼新的生理靶点。上述实验表明了PROCID系统不仅可以用来验证已知的蛋白-小分子互作，还可以揭示活细胞中未知的药物结合靶蛋白。

图8 达沙替尼结合位点与X射线共晶结构（PDB:6EG3）中SMARCA2的 ATP结合位点明显重叠

图8 PLA实验中达沙替尼诱导^ABDSMARCA2与PROCID系统邻近产生明显的荧光信号

综上所述，本文结合TurboID邻近标记酶和Halo tag蛋白，开发了一种基于邻近标记系统的小分子互作蛋白鉴定技术，实现了在生理状态下对小分子靶点的鉴定。

由于揭示小分子互作蛋白对于人们理解小分子及相关疾病的具体机制，避免潜在毒副作用和优化药物开发等方面均具有重要意义，开发新的有效小分子靶标鉴定工具是大家迫切的需求。（重要性）

已有技术将邻近标记酶与衔接蛋白结合到一起来探究小分子靶标，但是只能在体外进行反应，如何将能够有效鉴定小分子靶标的邻近标记系统导入体内，以有效鉴定药物分子的生理状态下的靶标蛋白是之前没有实现的。（挑战性）

TurboID产生的生物素-AMP酯可以与20 nm标记半径内的蛋白质暴露的赖氨酸残基发生反应，从而无偏地标记邻近的蛋白质。Halo tag蛋白可以高特异、高亲和地与其配体氯化烷烃形成不可逆的共价键，使得带有氯代烷烃修饰的小分子可以特异结合到Halo tag蛋白上，且一些药物如达沙替尼的探针开发已相当成熟。这使得文中PROCID系统构建成功的可能性大大提升。（可行性）

虽然通过PROCID系统不仅可以用来验证已知的蛋白-小分子互作，还可以揭示活细胞中未知的药物结合靶蛋白。但是其中关键的核心仍然是被化学修饰的小分子，文中使用的是已经经过大量验证有效的达沙替尼探针，并没有开发新的药物探针，而这一费时费力的化学修饰过程仍然是小分子靶标鉴定领域的一大障碍。文章并没有能够突破这一障碍，该靶标鉴定技术虽然有效，但适用范围有限，难以实现通用及高通量的需求。同时TurboID标记的不一定是药物结合蛋白，还有可能将20 nm邻近范围内的其他蛋白标记，这种无偏标记的特点使得该技术的假阳性结果可能偏高。（局限性）

理论上各种邻近标记酶例如BioID, APEX, PafA等都可以与不同“衔接蛋白”（SNAP tag, CLIP tag, Halo tag等）结合用于探究小分子-蛋白互作，且不一定是文中描述的这种配对效果最佳。（通用性）

TurboID邻近标记酶会将邻近20 nm范围内的蛋白生物素化，也许可以将一些特异性更强的邻近标记酶与Halo tag联用，更有利于鉴定到直接相互作用的特异性靶标。（拓展性）

参考文献：

[1]Matyskiela ME, Couto S, Zheng X, Lu G, Hui J, Stamp K, et al. SALL4 mediates teratogenicity as a thalidomide-dependent cereblon substrate. Nat Chem Biol. 2018;14:981-987.

[2]Cravatt BF, Wright AT, Kozarich JW. Activity-based protein profiling: from enzyme chemistry to proteomic chemistry. Annu Rev Biochem. 2008;77:383-414.

[3] Martinez MD, Jafari R, Ignatushchenko M, Seki T, Larsson EA, Dan C, et al. Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermalshift assay. Science. 2013;341:84-87.

[4] Qin W, Cho KF, Cavanagh PE, Ting AY. Deciphering molecular interactions by proximity labeling. Nat Methods. 2021;18:133-143.

[5]Hill ZB, Pollock SB, Zhuang M, Wells JA. Direct Proximity Tagging of Small Molecule Protein Targets Using an Engineered  NEDD8 Ligase. J Am Chem Soc. 2016;138:13123-13126.