大家分享一篇发表在Nature Chemical Biology上的文章，题目为“Detection of cell–cell interactions via photocatalytic cell tagging”。文章的作者是来自美国默克探索科学中心的Rob C. Oslund。

本文介绍了光催化细胞标记（PhoTag），用于使用与可光激活的黄素类辅因子结合的单结构域抗体（VHH）来展示细胞与细胞之间的相互作用。在用可见光照射后，黄素光催化剂生成用于靶向标记的苯氧基标签。使用该技术，我们证明了抗原呈递细胞-T细胞系统中PD-1/PD-L1的选择性突触标记。T细胞可以通过T细胞抗原受体（TCR）和肽-主要组织相容性复合体（pMHC）之间的结合事件与抗原呈递细胞（APC）形成细胞-细胞接触，对T细胞在驱动肿瘤免疫应答中的作用的日益认识促使人们在开发检查点抑制剂等方面做出了巨大努力。因此需要深入了解免疫细胞与其跨细胞靶之间形成的细胞接触。文章寻求开发一种基于光催化的标记技术，该技术有助于生成寿命更长的反应性物种，用于靶向细胞与细胞之间的相互作用。

蛋白质电子转移反应在生物和生物能量氧化还原过程中起着关键作用，特别是酪氨酸，是一种有效的电子转移中间体。而以黄素单核苷酸和黄素腺嘌呤二核苷酸形式的黄素辅因子在广泛的细胞环境中普遍用作光敏剂，以氧化富含电子的氨基酸侧链，包括酪氨酸残基的单电子氧化。反应性酪酰胺自由基中间体可以通过光控制黄素活化产生以递送生物素标签。我们的设计方案利用了黄素辅因子的激发态，通过单电子转移氧化苯酚底物，以在细胞-细胞界面附近生成反应性苯氧基细胞标记中间体（图b）。其机制如图c所示，其中在蓝色LED照明下的黄素催化剂1的光激发导致形成黄素单重态激发态，其通过系统间交叉37快速生成三重态激发的黄素2，从生物素酪酰胺3到强氧化三重态激发黄素物种的单电子转移应在自由基阳离子脱质子化后产生相应的苯氧基4。将主要酪氨酸残基添加到苯氧基中间体4中应提供交叉偶联的苯酚加合物5，随后通过黄素自由基物种6再生基态黄素光催化剂1。

首先进行黄素作为蛋白质标记光催化剂的鉴定，在核黄素光催化剂存在下，在PBS中用蓝色LED照射酪氨酸和生物素酚底物，可观察到所需偶联产物的形成。基于这一有希望的结果，我们通过监测各种光催化剂在可见光照射（455nm）下诱导生物素酪酰胺标记牛血清白蛋白（BSA）的效率，继续测试核黄素和其他合适的光催化剂用于蛋白质水平的标记（图a）。通过蛋白质印迹对各种催化黄素和其他氧化光催化剂进行初步筛选发现四乙酸核黄素（RFT）产生最高水平的蛋白质生物素化。接下来，我们将标记方法扩展到其他蛋白质，观察到在RFT和生物素酪酰胺存在下的光依赖性蛋白质生物素化（图b）。肽液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）对RFT标记的蛋白质的分析显示，在溶剂暴露的酪氨酸残基处的主要标记。生物素化仅检测到酪氨酸残基(红色)或色氨酸残基(绿色)。（图c）。

之后我们制备了一种抗体-黄素缀合物来驱动RFT定位到感兴趣的蛋白质。抗体-黄素缀合物是由叠氮丁酸NHS酯标记的抗体和炔- RFT之间通过点击化学反应生成的(图d)。一抗结合蛋白与感兴趣的蛋白结合，二抗-黄素结合蛋白识别一抗，用于靶向递送RFT光催化剂，接下来，我们通过在生物素酪胺的作用下靶向JY细胞上的PD-L1或CD86，或Jurkat细胞上的PD-1或CD45，对活细胞进行一抗/二抗标记(图e)。与同型抗体靶向标记相比，在没有光照射或表面受体表达的情况下，靶向标记导致细胞表面生物素化程度增加，JY野生型和Jurkat野生型分别不表达PD-L1和PD-1 (图f)。

接下来，为了确定PhoTag是否可以用于细胞-细胞接触环境下的标记，作者共培养了表达PD-1的Jurkat T细胞(Jurkat PD-1)和表达PD-L1的Raji B细胞(Raji PD-L1)，经葡萄球菌肠毒素D (SED)超抗原处理后，使MHC II/TCR接触。首先用抗PD-L1和二级抗体黄素结合物对Raji PD-L1细胞进行预标记，然后在SED和随后的可见光照射下与Jurkat PD-1细胞共孵育。共聚焦成像支持了这一结果，使用一抗/二抗PhoTag系统检测到明显的跨细胞生物素化证据。但由于膜间距离受限（图a）。这迫使我们探索使用较小的靶向物种结合PhoTag进行选择性免疫突触标记。使可以将PD-1/PD-L1结合相互作用的干扰降至最低。用人PD-L1免疫羊驼，构建PD-L1 VHH噬菌体文库，筛选文库，发现PD-L1结合的VHH不破坏PD-1/PD-L1的相互作用。然后将PD-L1 VHH基因在N端与人IgG Fc融合，生成VHH的二聚体形式。一个双叠氮素连接子(9)通过蛋白连接位点特异性连接到Fc的C端，随后通过click化学结合到RFT光催化剂上，生成抗pd - l1 VHH-Fc-RFT(图c)。其不会破坏PD-1/PD-L1的功能。然后使用Anti-PD-L1 VHH-Fc-RFT在Jurkat PD-1/Raji PD-L1双细胞系统中进行标记(图d)。对Anti-PD-L1 VHH-Fc-RFT介导的标记共聚焦成像显示，Jurkat和Raji细胞接触区域之间具有高度选择性和光依赖的标记，包括从同一细胞表面形成多个突触(图f,g)。当该方法应用于缺乏互补受体的共培养体系(Raji PD-L1和A375黑色素瘤细胞)时，检测到最小的跨细胞标记(图h,i)。

为了深入了解T细胞apc扫描相互作用的驱动因素，通过PD-1/PD-L1相互作用来研究PBMC衍生的T细胞与Raji细胞的相互作用。PBMC从健康的人类供体中获得，用CD3/CD28/CD2抗体混合激活3 天，然后在静置条件下培养4 天(图a)。这种细胞培养方案导致PD-1表面表达明显增加，且PD-L1极低或不诱导。然后将PBMCs与预先标记了抗PD-L1 VHH-Fc-RFT或同型VHH-Fc-RFT的Raji PD-L1细胞混合，孵育30分钟，然后用可见光照射5分钟(图4a)。与同型对照相比，抗PD-L1 VHH-Fc-RFT靶向标记检测到顺式和反式生物素化增加(图b)。用LFA-1/ICAM-1抑制剂(BIRT 377)44预培养PBMCs导致跨细胞标记减少，这表明标记是由于自然T细胞/APC相互作用而发生的(图b)。共聚焦成像分析显示生物素化指向细胞连接处，类似于共培养系统。其中CD3表面表达成像(品红)和细胞核成像(Hoechst染色，蓝色) (图c)。