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引言
核酸适配体是短的单链寡核苷酸,其亲和力和特异性与抗体相当。sgc8c是一种由41nt组成的DNA分子,选择性结合特定的白血病细胞。sgc8c的靶标是蛋白酪氨酸激酶7(PTK7),这是一种无催化活性的跨膜受体蛋白,与细胞生长和迁移有关。PTK7具有七个细胞外免疫球蛋白(Ig)结构域,可能有助于细胞粘附功能,而其细胞内结构域参与细胞信号传导,特别是通过Wnt和VEGF信号通路。高表达的PTK7是许多癌症的生物标志物,包括结肠癌、非小细胞肺癌症、胃癌和宫颈癌。因此,PTK7是有吸引力的CAR-T细胞疗法和抗体-药物偶联物的临床应用靶标。
靶向PTK7的适配体sgc8c已被用作检测癌细胞的分子探针以及细胞毒性有效载荷输送。虽然已有sgc8c在体内应用的报道,但核酸适配体存在易被核酸酶降解、血清半衰期短以及高脱落率等问题。该团队最近报道了利用可裂解亲电试剂修饰的适配体实现凝血酶的快速和选择性共价标记。他们将可裂解亲电试剂的范围扩大到不能被小分子靶向的蛋白质,其中最有效的方法是将N-酰基磺酰胺(NASA)亲电试剂转移到由适体介导的靶蛋白表面的亲核残基上,允许通过形成共价键进行选择性标记转移。共价适配体能够向靶标提供任何可以想象的功能手柄,甚至多个手柄。此外,共价键的形成确保了蛋白质在整个生命周期内永久的靶标接合。最后,快速标记转移动力学表明蛋白质标记优于核酸酶介导的适配体降解,这是基于细胞的核酸适配体实验的重要特征。总体而言,这些优点解决了传统核酸适配体的许多缺点。
成果简介
近日,匹兹堡大学Alexander Deiters教授团队在《J. Am. Chem. Soc.》上发表了题为“Cell Surface Labeling and Detection of Protein Tyrosine Kinase 7 via Covalent Aptamers”的研究论文。该团队介绍了共价适配体通过邻近驱动的标记转移修饰特定细胞表面蛋白的首次应用。此项工作中靶向一种突出的癌症标志物,即蛋白酪氨酸激酶7(PTK7),并证明了适配体介导的生物素转移到蛋白质细胞外结构域上的特定赖氨酸残基的可行性。这一工具的开发允许跟踪PTK7表达,定位和细胞内化。研究验证了共价适配体的可编程性,并强调了它们在细胞环境中的适用性,包括蛋白质和小分子递送。
图文解读
图1. (A)适配体介导的化学基序转移到蛋白质靶标的细胞表面结构域。(B) 炔烃改性亚磷酰胺(2)和N-酰基磺酰胺生物素转移亲电弹头(1)的结构。(C)sgc8c的预测结构。
图2. (A)用1修饰并与PTK7孵育的适配体的结构活性研究。(B)通过sgc8c-1对生物素化PTK7进行剂量响应。(C、D)通过sgc8c-1对脱靶标记BSA和补充血清的DMEM进行剂量反应分析。(E)PTK7生物素化的时间过程。
图3. 通过质谱法测定的具有生物素化赖氨酸残基(品红色)的PTK7(青色)的拟议模型。基于质谱结果,通过AlphaFold预测结构域结构。
图4. (A)生物素从sgc8c-1到HEK293T细胞上表达的PTK7或PTK7-CFP的共价转移,并用链霉亲和素树脂pull down。(B、C)分别是表达PTK7-CFP的HEK293T细胞的剂量和时间依赖性生物素化。
图5. (A)表达PTK3-CFP的NIH3T7细胞的活细胞成像,与sgc8c-1一起孵育并用NA-TMR染色。经过细胞NA-TMR染色后在37°C下孵育0小时(上)和2小时(下)。比例尺代表 10 mm。(B) PTK7阳性Jurkat细胞(左),PTK7阳性HepG2细胞(中)和PTK7阴性HEK细胞(右)与sgc8c(27)-1一起孵育并与SA-PE偶联的流式细胞术。(C)流式细胞术中藻红蛋白荧光平均强度的定量。
总结与展望
总之,该工作开发了共价适配体,不仅可以选择性地标记PTK7的重组形式,还可以在其天然细胞表面环境中表达。PTK7是一种重要的肿瘤生物标志物,被认为是淋巴癌、肝癌和许多其他癌症发展的驱动因素。目前存在关于使用亲电和光反应性基团的核酸适配体与细胞表面蛋白交联的报道,但本文是适配体介导的小分子选择性标记和有效转移的第一个例子。标记反应具有与核酸酶介导的适配体降解一样快的速度,并且能够在低适配体浓度下发生。观察生物素转移以选择赖氨酸残基,并用链霉亲和素荧光团标记细胞表面修饰的PTK7这使得能够定位PTK7。此外,还证明了通过流式细胞术对PTK7阳性急性淋巴细胞白血病和肝癌细胞的特异性检测。综上所述,这些结果证明共价适配体可作为潜在的癌症诊断工具和治疗剂。例如,它们可用于将多种荧光团递送到癌症生物标志物或捕获表达生物标志物的细胞,从而实现更可靠的诊断。此外,通过靶向递送药物货物到癌细胞,可以使用共价适配体提高治疗效果。
文章链接
https://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/jacs.3c02752
团队介绍
Alexander Deiters,匹兹堡大学教授
教育经历:
1993年—1998年 明斯特大学 化学学士
1998年—2000年Hoppe教授实验室 化学博士 对映体富集烯丙基锂物种的新环化反应
2001年 德克萨斯大学奥斯汀分校马丁教授实验室 博士后 吲哚生物碱全合成
2002年 拉霍亚斯克里普斯研究所舒尔茨教授实验室 博士后 非天然氨基酸的遗传密码扩展方法
研究方向:
a. 生物活性小分子–合成和方法开发
b. 通过细胞通路的小分子靶向发现药物
c. 用于研究生物过程的光化学工具
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