分享一篇2022年发表于nature communications的研究论文，Spatiotemporal-resolved protein networks profiling with photoactivation dependent proximity labeling，通讯作者是来自深圳湾实验室的李刚教授，当年影响因子为17.69分。本文主要介绍一种新型邻近蛋白标记技术——光激活依赖性邻近标记（PDPL），是邻近标记技术的又一深远拓展。

研究背景：

蛋白-蛋白相互作用（PPI）是细胞生命活动的基础，高保真的时空分辨PPI与生物体的生物途径、疾病病理相映射，因此发现并解析关键PPI是研究细胞精细调控的重要途径。传统PPI捕获技术，如亲和纯化质谱（AP-MS）、酵母双杂交等技术的实验流程决定其偏向捕捉持续稳定的PPI，因此迫切需要一种能够捕获瞬时微弱PPI的技术填补传统实验结果之外的空白。

针对上述局限，以APEX、BioID为代表的邻近标记技术（PL）被开发出来，成功捕获瞬时微弱的PPI。然而主流的邻近标记技术仍具有自身局限性，APEX的标记环境需要H₂O₂的催化，具有生物毒性难以实现体内应用；BioID酶促活性有限标记时间过长，后续定向进化的TurboID虽然标记迅速，但是内源性生物素的背景干扰严重。基于此作者开发出一种全新邻近标记技术——光激活依赖性邻近标记技术。

研究结果：

PDPL方法构建：

文献报道光敏剂受光照可以产生扩散距离为~70nm的单线态氧，可通过单线态氧对空间内有限的氨基酸残基进行氧化，受此启发作者设计出PDPL标记方法。简略地说，作者将光敏蛋白与目标蛋白融合质粒转染进细胞内，并添加外源性含有炔烃手柄的探针，给予蓝光照射后激发光敏蛋白催化产生单线态氧，对周遭蛋白上的组氨酸残基进行氧化并促进其与外源性探针的结合，便于后续富集与蛋白质组学分析（见图1a）。经多次优化，最终将反应条件确定为照射波长-460nm，照射时间-20min，化学探针浓度-1mM（见图1b-d）。

PDPL标记法主要包括四点特征：

1.以类似酶促PL的方式产生反应性单线态氧；

2.通过光照方式启动时间分辨标记；

3.通过改变光照时间控制标记半径调整空间分辨；

4.避免使用内源性物质使用，减少背景干扰；

Fig.1 Development and characterization of photoactivation-dependentproximity labeling method.

PDPL标记位点的表征及体外标记的验证：

文献报道单线态氧可氧化多种亲核氨基酸残基，但本实验中发现标记位点几乎为组氨酸而非其他，这是由于优化使用的探针对组氨酸的结合效率高。经PDPL标记流程后，列出具有超过50个肽谱匹配的蛋白质组修饰，理论计算后确定质量位移（mass shift）+229Da为两次氧化产物，+247Da为229的水解产物，并给出了MS2的辅助鉴定信息（见图2a-c）。在模型蛋白PRDX3和PRDX1中组氨酸突变为丙氨酸后进行PDPL标记，标记效率大大降低，在分子生物学层面验证了PDPL的可靠性（见图2d）。

Fig.2 Characterization of PDPL labeling sites and validation of labeling in vitro.

PDPL鉴定细胞器特异性蛋白质组：

PDPL的标记方法构建成功后，作者希望将该方法应用于亚细胞器蛋白质组描绘，于是作者在HEK293T细胞的细胞核、线粒体及内质网外膜稳定表达miniSOG，凝胶荧光分析发现不同细胞组分的蛋白组具有不同的标记模式，荧光成像也发现PDPL有高度空间特异性（见图3a-c）。

通过非标定量蛋白质组学分析，以未转染的HEK293T细胞为阴性对照，处理蛋白质组学数据绘制火山图，突出显示富集蛋白（红点）与仅在miniSOG表达体系鉴定到的蛋白（绿点），结合上述数据对比GO富集分析与A. Ting等数据库，验证所检测到蛋白的细胞器特异性（见图3d-e）。

Fig.3 PDPL allows for subcellular proteomic profiling in mitochondria, ER,and nucleus.

BRD4结合蛋白的时空解析谱图：

完成上述对PDPL标记方法各方面评价，便将此方法应用于实际科学问题的解决。作者不仅期望PDPL对细胞器蛋白进行捕获，更希望对游离程度高捕获难度大的胞质蛋白进行标记，于是选中在多种疾病中起关键作用的BRD4蛋白。

将miniSOG与BRD4蛋白融合过表达，给予不同时间段的光照进行标记，短时间用以捕获直接结合靶标，长时间光照用于捕获靶蛋白与结合蛋白的间接靶标。实验结果发现，相邻光照时间段的标记谱具有高度重复性，在2min组中识别的蛋白进行GO分析，发现其主要集中于染色质重塑与RNA聚合酶功能，与文献报道BRD4功能一致（见图4a-d）。

Fig.4 Spatiotemporally-resolved profiling of BRD4 binding proteins with different labeling radii triggered by illumination duration.

总结：

PDPL技术是邻近标记技术的新拓展，基于miniSOG光敏蛋白受蓝光照射催化产生单线态氧，进一步氧化靶蛋白邻近蛋白的亲核氨基酸残基，使其与化学探针结合。本方法比较巧妙的构思在于通过光照时间与光敏蛋白定位过表达实现时间与空间的高级分辨。本方法采用的miniSOG仅为12KDa，是APEX的二分之一，TurboID的三分之一，对细胞正常生命活动影响甚微，标记环境更贴近正常生理状态，置信度更高。另外，本方法特异性良好，不仅在亚细胞器中成功原位标记，且成功捕获靶蛋白除已知靶标外的其他互作蛋白，并成功验证未知靶标的真实性。