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介绍一篇来自“Journal of the American Chemical Society”的文章,题名为“Cell Surface Labeling and Detection of Protein Tyrosine Kinase 7 via Covalent Aptamers”。
共价适配体是一种新型的生物化学工具,可将标签快速选择性地转移至靶蛋白。这些核酸探针配备了可裂解的亲电试剂,能够将功能手柄安装到天然蛋白质上。在这里,作者介绍了共价适配体首次应用于通过近端驱动标记转移修饰特定细胞表面蛋白。
作者将N-酰基磺酰胺 (NASA) 亲电子试剂置于适配体介导的目标蛋白表面亲核残基附近,从而通过共价键形成实现选择性标记转移(图 1A) 。
图1
将修饰的sgc8c-1适配体与重组PTK7孵育,使用链霉亲和素-辣根过氧化物酶 (SA-HRP) 融合蛋白通过简化的免疫印迹分析生物素转移的效率(图2A)。结果表明,适配体的环结构域与 PTK7 相互作用的潜力更大。接下来,作者研究了试管中 PTK7 标记的动力学。实验表明,适配体介导的 PTK7 生物素化发生时标记t1/2为 86 min,并在 4 h内达到稳定水平(图 2E)。这些结果有望转化为细胞环境,因为标记和酶降解具有相似的动力学。建立动力学后,作者检查了 sgc8c(27)-1对 PTK7的选择性(图 2C),发现 250 nM是细胞中 PTK7 生物素化的最佳适配体浓度。
图2
为启动适配体介导的共价 PTK7 生物素化从试管到哺乳动物细胞的翻译,组装了 PTK7-青色荧光蛋白 (CFP) 融合的表达构建体。PTK7 和 PTK7-CFP 的检测验证了两种构建体的成功蛋白质生物素化,证明了共价修饰以及融合构建体确实不会破坏适配体-蛋白质相互作用。
然后,作者测试了共价适配体通过货物内化特异性标记、检测和跟踪 PTK7 定位的能力。CFP 和罗丹明荧光成像(图 3A) 显示了 PTK7-CFP 表达细胞的特异性标记,而其他不表达 CFP 融合的细胞未标记。观察到的定位与先前的研究一致,先前的研究表明 PTK7 通过小窝蛋白介导的内吞作用内化。这些结果表明,通过共价适配体的蛋白质标记甚至可以应用于货物的特定细胞递送,包括蛋白质和小分子。
图3
总之,作者开发了共价适配体,不仅可以选择性标记重组形式的 PTK7,还可以在其天然细胞表面环境中表达。此外,作者还证明了通过流式细胞术可以特异性检测PTK7阳性急性淋巴细胞白血病和肝癌细胞。这些结果为共价适配体作为潜在的癌症诊断和治疗剂的应用奠定了基础。
本文作者:QHJ
责任编辑:FJY
原文链接:https://doi.org/10.1021/jacs.3c02752
DOI: 10.1021/jacs.3c02752
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