分享一篇发表在Nat Commun.上的文章，标题“Spatiotemporally-resolved mapping of RNA binding proteins via functional proximity labeling reveals a mitochondrial mRNA anchor promoting stress recovery”。通讯作者是斯坦福大学遗传学、生物学教授，兼化学教授 Alice Y. Ting，主要研究方向：开发、扩大规模和广泛传播用于映射细胞和功能电路的分子技术开发、扩大规模和广泛传播用于映射细胞和功能电路的分子技术。 
具有基因靶向混杂酶的邻近标记（PL）能够无偏发现蛋白质组。在PL中，一种工程化的混杂标记酶，如APEX3，TurboID4或BioID5，通过遗传融合靶向特定的亚细胞区室或大分子复合物。向活细胞中添加小分子底物可导致从混杂酶的活性位点催化产生活性生物素种类（例如用于 APEX 的生物素-苯氧基自由基或用于 TurboID 的生物素-AMP），其向外扩散以共价标记近端内源性蛋白。PL可以在特定的亚细胞区域无偏地发现蛋白质或RNA，如果能够将PL的时空特异性和活细胞相容性与基于功能活性或共价修饰（“功能邻近标记”）富集蛋白质或RNA的靶向方法相结合，就可以在活细胞的不同区室中绘制特定的蛋白质亚类。图1为磷酸化和O-连接-N-乙酰葡糖胺化(O-GlcNAcylated)蛋白的区室特异性富集作者验证是否有可能将PL工作流程与各种功能蛋白质富集方法相结合，用一种PL酶：APEX2（一种工程化的过氧化物酶），可催化生物素-苯酚偶联物的单电子氧化。这种氧化的自由基产物与富含电子的蛋白质侧链（如酪氨酸）形成共价加合物。标记是通过向活细胞中添加生物素-苯酚和 H2O2 来启动。实验探索了基于APEX（一种工程化的过氧化物酶）的PL与通过固定化金属亲和色谱（IMAC）富集磷酸蛋白或通过小麦胚芽凝集素（WGA）亲和色谱富集O-GlcNAcylated蛋白的组合。作者首先验证了在H 2 O 2存在下的1分钟标记不会改变全局磷酸化或O-GlcNA酰化水平。然后对经过双重富集的已知的核磷酸蛋白以及其他亚细胞区域的磷酸蛋白进行了蛋白质印迹，结果只有核磷酸蛋白SMAD2和组蛋白H3富集。类似地，核O-GlcNAcy化蛋白被WGA和链霉亲和素串联特异性捕获。证明这种双重富集方案具有特异性。图2 开发用于亚细胞RBP功能邻近标记的APEX-PS为了测试和优化串联APEX和OOPS（“APEX-PS”），实验用生物素-苯酚进行APEX-NLS标记，然后用FA处理细胞（使蛋白与RNA交联）。对细胞裂解物进行OOPS，最后进行链霉亲和素珠富集。通过该程序回收了许多生物素化的蛋白质，而在在阴性对照中省略H2O2（抑制APEX催化的生物素化）或FA，这些蛋白则没有被富集。实验又对富集裂解物进行了已知核RBP和脱靶蛋白标志物的蛋白质印迹来检测核APEX-PS富集蛋白的身份，最终检测到核RBP ，而未检测到线粒体RBP 和核非RBP。作者又用UV代替FA测试了APEX-PS工作流程，结果显示，与FA相比，UV交联的捕获效率大大降低，而RBP特异性保持不变。为了优化APEX-PS，作者还测试了逆转APEX和FA交联步骤，发现APEX优先方法更具特异性。图3 通过APEX-PS对核RBP进行蛋白质组学分析实验进行了基于TMT的细胞核靶向的APEX2-NLS多重蛋白质组学实验。总共检测到1782种蛋白质，每种蛋白质具有两种或多种独特的肽。作者对最终获得的核RBPome进行GO分析，分析结果显示RNA相关项的富集以及细胞核相关项的显着富集。作者又将获得的核RBP数据集与通过serIC和RBRID方法获得的核RBP数据集进行了比较（serIC是将核分馏与重复寡核苷酸RBP纯化相结合，RBRID是基于由于RNA-蛋白质交联导致的MS中亲本肽特征的缺失），结果显示，以相同方式定量的APEX-PS数据集具有高特异性和三种方法中最高的灵敏度，并且APEX-PS确定了OOPS遗漏的272个往往是低丰度的核RBP。实验在稳定表达靶向核仁的APEX2的HEK293T细胞中进行了三次APEX-PS的生物学重复。GO分析显示核仁RBP数据集在预期的生物过程显著富集。获得的核仁蛋白中81%和96%分别具有先前的核和RNA结合注释。与全局 OOPS 进行比较，OOPS遗漏了86个核仁RBP，并且这些通常是低丰度蛋白质。类似的，聚（A）依赖性方法遗漏了92个核仁RBP。实验得到的核仁RBP数据集包含九种“孤儿”蛋白（既没有先前的RNA结合，也没有核仁注释）。选择其中两个孤儿蛋白（MIS18A和ATAD5）进行验证，在蛋白质印迹显示核仁中的APEX-PS（UV）富集了这两种蛋白质，其次使用正交RBP富集方法，发现MIS18A在核仁中高度富集，而ATAD5广泛分布在细胞核中，与核仁标记重叠。这些数据表明核仁RBPome可以开采新的核仁定位RNA结合蛋白。在HEK293T细胞中稳定表达APEX2-OMM来鉴定OMM（线粒体外模）定位的以翻译和核糖体非依赖性方式与RNA结合的RBP，用细胞质APEX2-NES作空间参考对照，并且纳入两个用嘌呤霉素（PUR，嘌呤霉素抑制蛋白质翻译并分解多聚体）处理的细胞重复。在基础和PUR处理条件下，分别鉴定出28个和15个OMM定位的RBP。+PUR数据集几乎是基础（−PUR）数据集的子集。得到的OMM RBPome中的大多数蛋白质具有先前的线粒体注释（~72%）和RNA结合注释（~76%）。实验选择了其中五种蛋白（TAX1BP1，RMDN3，MARC1，SYNJ2BP，EXD2），使用基于紫外线的APEX-PS和代谢标记方法进行后续验证，所有这五种蛋白质都被验证为真正的RBP。由于EXD2定位于OMM和细胞核，实验并行进行了APEX2-OMM和APEX2-NLS标记，结果显示EXD2优先与OMM处的RNA结合。
图6 分析OMM定位的RBP SYNJ2BP的mRNA客户端SYNJ2BP 已被 pCLAP57 鉴定为 RBP，但在其他 RBP 分析研究中未被检测到，也没有后续的生化实验研究 SYNJ2BP 的 RNA 结合功能。作者进行了RNA免疫沉淀和测序（RIP-seq）来进一步探测SYNJ2BP的功能。在富集的100多个mRNA中选择了其中的11个用PUR处理，结果表明SYNJ2BP与这些mRNA结合是核糖体非依赖性的，并且在PUR处理后仍定位于OMM。实验又使用OMM定位的APEX直接生物素化野生型和SYNJ2BP敲除HEK293T细胞中OMM处的RNA，并用PUR处理，结果发现当SYJN2BP不存在时，11个mRNA中有5个在OMM处显著减少，表明与SYNJ2BP结合是PUR处理后在OMM保留特定mRNA亚群的主要机制，但存在其他机制在基础条件下将这些mRNA募集到OMM。图7 SYNJ2BP在OMM处保留特异性线粒体mRNA，以促进应激后线粒体功能的恢复作者检查了在基础条件下、PUR处理后和PUR处理后恢复的12小时，SYNJ2BP KO对这些基因编码的蛋白质水平的影响。结果显示在基础和PUR条件下未观察到蛋白质水平的变化，但是在PUR恢复后12小时，五种蛋白质的丰度均降低，SYNJ2BPKO明显损害了所有五种蛋白质的翻译。由于一些与OXPHOS相关的mRNA是SYNJ2BP的“客户”，作者又测试了经PUR处理后复合物III和复合物IV的活性，结果发现在应激恢复过程中，SYNJ2BP的损失损害了复合物III和IV的活性以及整体细胞活力。作者也探究了SYNJ2BP在线粒体健康中的作用，发现在PUR特异性翻译抑制应激之后，SYNJ2BP在OMM上保留了特定的线粒体转录物，这有助于改善OXPHOS的恢复，线粒体ATP的产生以及细胞从这种胁迫中生长。作者又使用热或亚砷酸钠来应激细胞，结果上述五种mRNA在SYNJ2BP敲除细胞中大部分从OMM上消失，并且翻译也被抑制，表明SYNJ2BP也在从其他类型的翻译应激中恢复线粒体功能中发挥作用。本文将PL的时空特异性与功能蛋白质富集的方法相结合，在活细胞的不同区室中绘制了特定的蛋白质亚类，生成了核、核仁和线粒体外膜 （OMM） RBP 的数据集，并将这些数据集可用于新功能研究。原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34404792/原文引用：https://doi.org/10.1038/s41467-021-25259-2
目前评论：