Nat. Chem. | 利用四嗪连接实现针对蛋白内源β-氨基酸亲二烯体的位点选择性生物正交标记

  • A+

分享一篇发表在Nature Chemistry上的文章，文章标题为“Site-specific bioorthogonal protein labelling by tetrazine ligation using endogenous β-amino acid dienophiles”。其通讯作者是来自ETH Zurich的Jörn Piel教授。其课题组的主要研究兴趣为了解微生物如何制造结构复杂的天然产物，以及生物合成独特的生物活性天然产物。。

1

生物正交化学在生物学研究和医学中得到了广泛的应用。最有前景的生物正交反应之一是通过逆电子需求Diels-Alder（IEDDA）环加成将四嗪与亲二烯体连接，这种快速反应比其他生物正交反应更具选择性。四嗪技术的一个局限性是需要将非天然亲二烯体掺入蛋白质靶标中，这通常是通过遗传密码扩展或酶介导的连接来实现的，需要添加外部携带亲二烯体的化学试剂。直接在靶蛋白上从头生产独特的亲二烯体将消除对外部试剂的需求，减少合成工作量，并限制底物分子和密码子扩展引起的副反应和毒性。

在本文中，作者利用核糖体合成和翻译后修饰肽（RiPP）生物合成中自然发生的转化来完成IEDDA位点的体内生成。RiPP由翻译后成熟酶生物合成，这些酶作用于核糖体产生的前体肽，并安装具有多种功能的各种非天然氨基酸。作者在先前的研究中发现了一种独特的细菌RiPP修饰，它将前体XYG基序中的氨基酸X转化为相应的ɑ-酮-β-氨基酸残基，以下称为酮酰胺。这种修饰是通过剪接酶复合物PlpXY实现的，其中PlpX属于自由基S-腺苷蛋氨酸（rSAM）超家族。它催化酪氨酸酪胺部分的切除和剪接肽末端的重新连接，从而将酪氨酸剩余的酰胺羰基融合到前一个氨基酸的羰基上。由此产生的同源X残基是一种α-酮-β-氨基酸衍生物，在细胞中具有独特的化学反应性。在这里，作者利用这种肽修饰实现了细菌细胞中靶蛋白的体内生物正交IEDDA标记。

2

图1 PlpXY的工作原理


基于之前报道的四嗪与醛、酮之间的反应，作者测试了酮酰胺是否也具有类似的反应性。对于模型反应，作者合成了氨基丙酮酸衍生物1，以研究其IEDDA反应性以及各种添加剂的催化作用。将化合物1与四嗪2在37 °C的水溶液中孵育18小时，并尝试了L-脯氨酸，Ca2+或Mg2+等添加剂的作用。通过LC-MS监测产物形成和添加剂对产物产量的影响，结果显示，在水中，各种条件下二者都会发生反应，且L-脯氨酸和其他添加剂都没有导致转化率显著提高。然而，在PBS中观察到产量提高了20倍，这可能是由于磷酸盐可以作为烯醇化催化剂。此外，作者观察到PBS中存在的烯醇含量与D2O相比显著增多。作者还分析了反应的动力学，在25℃的PBS中通过紫外-可见光谱法分析，记录了30 min内在515 nm处吸收强度的下降，采集的数据遵循二阶反应机理，给出的二阶速率常数为 0.625(15) M−1s−1.最后，作者通过LC分析了偶联物4和5的稳定性，结果显示，3天后，化合物的紫外线信号减少不到25%。
3

图2 氨基丙酮酸模型化合物1的试验反应


接下来，作者对来自蓝藻胸膜藻PCC 7319的原型剪接酶PlpXY进行了测试，它天然作用于MYG和LYG肽位点，具有GYG基序的天然底物PlpA3的点突变体也被接受为底物。为了测试IEDDA是否与多肽相容，N端具有组氨酸标签的GYG前体突变体的标记变体His6-PlpA3-M5G（117个氨基酸），通过质粒与剪接酶PlpXY共表达。对肽链的NTA亲和纯化以及与四嗪的体外偶联验证了PlpXY可以将底物成功转化为含氨基丙酮酸的产物。使用亲和纯化的多肽，接下来研究了His6-PlpA3-M5G与一系列四嗪试剂的IEDAA反应。将四嗪2加入到PBS中，并在20°C下孵育18小时。通过MS分析和随后的质量反卷积证实了与四嗪探针2的蛋白质偶联。有限的转化是由于底物和PlpXY共表达过程中酶促步骤不完全，市售荧光四嗪衍生物CF®488A也获得了类似的结果，凝胶电泳和荧光成像验证了荧光团的掺入。通过剪接目标蛋白以在体内生成生物偶联底物并随后进行体外IEDDA环化，能够生成标记的His6-PlpA3-M5G，作者将这种方法称为TyrEx（酪胺切除）环加成。

4

图3 His6-PlpA3-M5G与四嗪的体外偶联


在天然剪接酶底物的背景下建立TyrEx环加成后，作者设想是否可以将其用于与剪接酶或RiPPs无关的非天然靶蛋白。作者选择了 Her2/ErbB2 -binding Affibody作为模型蛋白，想要通过TyrEx对Affibody进行化学修饰。为了制备亲二烯体底物，作者制备了一个N端含有His标签 ，C端融合含有GYG基序的PlpA2的最小10氨基酸核心的Affibody，命名为His6-ZHer2:342-GYG，并与剪接酶PlpXY一起在大肠杆菌中共表达。亲和纯化和LC-MS/MS分析表明存在反应性氨基丙酮酸残基。作者随后在剪接的Affibody上与DOTA-四嗪进行了IEDDA反应，得到Affibody-DOTA偶联物ZHer2:342-TyrEx-DOTA，通过LC-MS分析和随后的质量反卷积证实了产物的形成。
5

图4 生产用于通过 TyrEx 环加成进行标记的Affibody 偶联物


为了验证是否保留了Affibody的结合功能，作者将ZHer2:342-TyrEx-DOTA和前体蛋白 ZHer2:342-GYG通过高效液相色谱纯化，并通过ELISA分析了二者和ZHer2:342-Cys-DOTA与Her2的亲和力，结果表明三者的亲和力相当。 为了表征蛋白的稳定性，将三种蛋白在37°C下在人血浆中孵育3天，两种偶联物之间没有显着差异，但用GGPIRPGYGLPI序列标记的前体降解非常快，4 h后剩余低于50%。降解产物的MS分析表明，修饰位点的脯氨酸-甘氨酸键N端被降解，因此作者认为降解不是偶联的结果，而是肽序列本身的结果，因为偶联蛋白的降解速度比未偶联的前体慢。

随着蛋白的体外成功标记，作者进一步希望对细胞进行标记。作者选择了细胞分裂蛋白FtsZ进行荧光成像，通过在蛋白质的八个位置插入剪接标签序列来探测大肠杆菌 FtsZ 的表面位点。将含有GYG区的不同剪接酶识别基序引入到FtsZ的N端或C端，或者插入氨基酸G55-Q56，A53-V54，E35-G36或S218-E219之间的内部位点，L325-D337和E350-Q364也被剪接酶基序序列取代。首先，作者对这些变体进行了纯化和剪接反应验证，虽然大多数修改产生了可溶性FtsZ变体，但只有两种变体FtsZ-E350-Q364和FtsZ-G55-Q56在GYG位点成功拼接。因此，作者选择了FtsZ-G55-Q56与CF488A四嗪探针进行了体外偶联测试，并通过凝胶电泳成像评估标记效果。凝胶荧光成像和考马斯染色在FtsZ的预期分子量区域显示出明显的条带，而使用非剪接蛋白的对照实验中未观察到荧光。

8

图5 通过TyrEx环加成对细菌中的FtsZ进行选择性成像


有了合适的FtsZ变体，作者接下来研究了同一细胞中的细胞内的蛋白质剪接，标记和成像。作者在大肠杆菌中分别表达了靶蛋白FtsZ-G55-Q56和PlpXY剪接酶，用甲醛固定大肠杆菌细胞并用Triton X-100透化，与6进行孵育， 随后，洗涤细胞并通过共聚焦激光扫描显微镜分析。结果表明，探针仅对含有FtsZ变体、剪接酶的组别进行了选择性染色，且荧光位于Z环结构的隔膜以及分裂细胞的极点上，其中FtsZ被隔离在固定相细胞极点形成的颗粒中。在时间依赖性实验中，作者观察到FtsZ与PlpXY的共表达需要至少12小时才能获得足够的酶活性。这些结果表明，TyrEx生物偶联可以通过引入短肽标签来荧光标记细胞中的蛋白质，从而为现有的细胞内标记方法提供了一种有吸引力的替代方案。

这项研究描述了一种新型的四嗪连接策略，称为TyrEx环加成，它基于细菌细胞中自主的亲二烯体的生成。该方法利用独特的酮酰胺单元，通过在遗传引入的GYG位点进行酶骨架剪接掺入靶蛋白中。TyrEx环加成系统的几个特点使其对蛋白质偶联很有吸引力。首先，蛋白质剪接系统不存在于大肠杆菌或哺乳动物细胞中，这使得靶蛋白的翻译后修饰具有生物正交性和遗传可处理性。其次，直接在靶蛋白上从头产生亲二烯体消除了通过酶介导的连接或非天然氨基酸掺入的需要。第三，亲二烯体位于蛋白质主链上，减少了标记的接头长度和蛋白质修饰的有效尺寸。因此，通过TyrEx制备抗原结合蛋白偶联物为现有方法提供了一种替代策略，可以规避其他方法的缺点，并且在荧光蛋白标记中，小尺寸的TyrEx标签可以应用于较大尺寸的GFP不兼容的体系。


文章作者：HYD

DOI：10.1038/s41557-023-01252-8


weinxin
我的微信
关注我了解更多内容

发表评论

目前评论：