介绍一篇2021年12月发表于Angew. Chem. Int. Ed.的文章，题目为“A Dual-Color Fluorescent Probe Allows Simultaneous Imaging of Main and Papain-like Proteases of SARS-CoV-2-Infected Cells for Accurate Detection and Rapid Inhibitor Screening”。主要蛋白酶（Mpro）和木瓜蛋白酶样蛋白酶（PLpro）在SARS-CoV-2的复制过程中发挥着重要作用，是抗病毒抑制剂的重要靶点。对Mpro和PLpro进行同时可视化，对于严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV2）的检测和抑制剂的快速筛选而言非常重要。然而，由于缺乏合适的探针，实现这一目标仍然具有很大的挑战性。基于此，该文章开发了一种双色探针3MBP5，它能通过荧光共振能量转移（FRET）同时检测Mpro和PLpro。该文章的通讯作者是来自加州大学圣地亚哥分校的Jesse V. Jokerst教授，研究方向为基于光学、声学和纳米技术的体内外成像技术。
由SARS-CoV2引起的新冠肺炎疫情持续威胁着全球健康。了解病毒生命周期和相关蛋白酶的分布对控制疾病传播、诊断感染和筛选治疗方法至关重要。Mpro和PLpro是由冠状病毒RNA基因组的开放阅读框（ORFs）特异性编码的非结构性蛋白酶，在SARS-CoV-2病毒复制中处理病毒前体多聚蛋白，形成功能蛋白，起着关键作用。Mpro在Leu-Gln（LQ）序列之后裂解病毒多聚蛋白，PLpro在Leu-Xaa-Gly-Gly（LXGG）序列之后裂解病毒多聚蛋白，可以去除类似泛素的ISG15蛋白修饰，以及Lys48的修饰，以调节病毒传播和先天免疫。它们的氨基酸序列在SARS-CoV、SARS-CoV-2和中东呼吸综合征中高度保守，是病毒检测和药物开发的合适生物标志物。目前，它们的功能和在SARS-CoV2感染细胞中时间和空间分布及其具体功能仍不明确。多种方法已被应用于复杂生物样品中多种生物标志物的同时检测，包括重组荧光蛋白、基于纳米粒子的光学和电化学传感器等。其中，FRET荧光探针可以报告活细胞中的生化过程，具有信号采集快、检测灵敏度高、背景低、非侵入性等优点，引起了人们的极大兴趣。同时，多色FRET探针也被应用于多种生物分子的距离、结构和相互作用的确定。目前有多种商用和研究级的用于Mpro和PLpro的底物，并显示出了良好的特异性和选择性。然而，这些方法都是单通道筛选，难以确认两种不同的探针在同一细胞内的浓度，影响细胞成像分析的精度。
作者设计并合成了一种名为3MBP5的双色荧光探针，用于在SARS-CoV-2感染细胞中同时观察Mpro和PLpro。3MBP5包括五个部分（图1a）：Cy3、Mpro响应肽、BHQ-2、Mpro响应肽和Cy5。这些组分通过基于Fmoc的固相肽合成，硫醇-马来酰亚胺加成和铜催化叠氮化物-炔键反应进行共价连接。当多肽完整时，3MBP5在Cy3和Cy5通道的荧光被BHQ-2有效地淬灭（图1b）。经Mpro和PLpro切割后，Cy3和Cy5不再被BHQ2猝灭，其荧光强度将显著增强。加入Mpro和PLpro抑制剂后，Mpro和PLpro的蛋白酶活性受到抑制，荧光信号随抑制剂浓度的增加而减弱。因此，可以通过荧光变化来监测Mpro、PLpro及其抑制剂的活性，为同时检测蛋白酶和快速筛选抑制剂提供一条新的途径。
图1 3MBP5的结构和功能
商业化荧光染料Cy3、Cy5和BHQ-2的吸收和发射光谱具有相当大的重叠，被选作最佳FRET对。为了避免Cy3和Cy5之间发射光谱的重叠，作者分别选择500 nm和600 nm作为Cy3和Cy5的最佳激发波长。考虑到供体和受体之间的空间距离，将两个供体（Cy3和Cy5）设置于蛋白酶可清除肽的两端；BHQ-2位于中心，再根据FRET效率和底物长度，选择Cy3-BHQ-2对用于Mpro检测，Cy5-BHQ-2对用于PLpro检测，实验计算和分子模拟的供体-受体距离一致，表明Cy3、Cy5和BHQ-2可以被用于设计双色FERT探针。作者选择Cy5-BHQ-2作为对照探针来验证底物的特异性和酶活性：BRM5（R代表四聚精氨酸的缩写）用于检测Mpro，BRP5和3EBP5用于PLpro的检测。这里，E是用于PLpro检测（图2a）的具有Gln到Glu突变以防止Mpro与底物相互作用的Mpro响应序列的缩写。为了提高BRM5和BRP5的溶解性和细胞通透性，在BRM5和BRP5中引入了亲水性的四聚精氨酸，可以促进探针进入细胞，减少探针在细胞微环境中的降解。所有产物均经高效液相色谱（HPLC）纯化（图2b），并使用电喷雾电离质谱（ESI-MS）对其化学结构进行了表征（图2c）。以上结果证实了3MBP5、3EBP5、BRM5和BRP5的成功合成。
图2 3MBP5及其衍生物的特性
作者研究了3MBP5与Mpro、PLpro及其抑制剂的潜在光谱性质（图3a）。BHQ-2在400-720 nm处显示出宽范围的的吸收光谱（图3b）。在500 nm的激发下，3MP5中Cy5的荧光强度明显增强，显示Cy3与Cy5之间存在显著的FRET效应（黄线，图3c）。经BHQ-2修饰后，由于BHQ-2的有效猝灭效率，3MBP5中Cy3和Cy5的荧光强度明显降低（粉色线，图3c, d）。此外，作者将BRM5、BRP5、3EBP5和3MBP5与不同浓度的Mpro和PLpro孵育，以验证探针的灵敏度（图3e, f），BRM5、3MBP5的荧光强度随Mpro浓度的增加而逐渐增强，BRP5、3EBP5、3MBP5均被PLpro激活。随着时间的推移，作者还记录了3MBP5与Mpro和PLpro孵育的动力学研究。3MBP5在560 nm（500 nm激发）条件下的荧光强度在Mpro孵育20 min内达到峰值（图3g），而PLpro在660 nm（600 nm激发）条件下孵育超过3 h（图3h）。作者评估了三种不同来源的PLpro蛋白酶，并注意到类似的结果。接下来，在相同的条件下，将3MBP5、BRM5和BRP5分别用不同的对照蛋白（凝血酶（TB）、血红蛋白（HGB）和牛血清白蛋白（BSA））处理，以考察其选择性（图3i, j）。3MBP5细胞中Cy3和Cy5的荧光强度仅在与Mpro和PLpro孵育时才明显增强。在Cy3通道中，与Mpro单独孵育相比，Mpro和PLpro共孵育BRM5和3MBP5可产生更强的荧光，荧光增强率分别为33.6%和40.4%。然而，在Cy5通道中，BRP5、3EBP5和3MBP5与Mpro和PLpro共孵育后，与单独孵育PLpro相比，荧光强度几乎没有区别。接着作者利用商业化的Mpro抑制剂GC376和PLpro抑制剂GRL0617来确定该探针是否可以用于Mpro和PLpro抑制剂的筛选。随着抑制剂浓度的增加，Cy3和Cy5信号显著降低（图3k, l）。结果表明，3MBP5可以同时检测Mpro和PLpro抑制剂，具有快速筛选抑制剂的潜力。
图3 光物理性质和通过蛋白酶激活探针
接下来，作者使用3MBP5进行细胞成像，用3种不同质粒转染HEK 293T细胞：SARS-CoV-2 Mpro质粒、SARS-CoV-2 PLpro质粒和对照流感病毒蛋白（A/PR8/1834 NP，简称PR8）质粒。转染质粒的HEK 293T细胞随后与不同的探针、Mpro和PLpro抑制剂共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察（图4a）。首先对Cy3和Cy5的细胞成像孵育时间、探针浓度和光学参数进行优化。将不同浓度（1.0 µM、2.0 µM、4.0 µM和8.0 µM）的Cy3和Cy5与HEK 293T细胞在标准细胞培养条件下共培养3小时。选用工业染料Hoechst 33258对细胞核进行染色。根据CLSM图像和细胞毒性分析，2.0 µM Cy5足够用于细胞成像。较高浓度的Cy5可能导致高背景和细胞毒性。此外，为了验证非特异性卵裂并避免假阳性信号，单DMEM不能激活探针。在Mpro处理的DMEM中，3MBP5的Cy3荧光信号在15 min内迅速增加，10%胎牛血清在DMEM中孵育30 min后切割肽段，孵育95 min后荧光达到最大值。这种裂解明显慢于Mpro的裂解（80分钟）。结果表明：（1）Mpro在细胞培养基中具有比PLpro更强的稳定性和活性；（2）延长培养时间会导致3MBP5在复杂细胞培养基中的非特异性激活。因此，每个探针2.0 µM孵育30 min是细胞成像实验的最佳选择。 为了评估质粒转染的HEK 293T细胞中的Mpro和PLpro活性，作者用2.0 µM BRM5和2.0 µM BRP5孵育30分钟后进行CLSM细胞成像实验，在Mpro或PLpro质粒转染的细胞中观察到BRM5和BRP5的红色荧光，在PR8质粒转染的细胞中没有红色荧光。它们的荧光强度随着质粒浓度的增加而明显增加。此外，作者将Mpro和PLpro质粒转染的细胞与2.0 µM 3MBP5孵育30分钟。与裸细胞或PR8转染细胞的微弱荧光相比（图4b, f），Mpro质粒转染的细胞显示明显的绿色荧光（图4c），PLpro质粒转染的细胞显示强烈的红色荧光（图4d）。只有Mpro和PLpro质粒共转染的细胞同时显示绿色和红色荧光，导致黄色重叠（图4e）。为了验证使用3MBP5进行基于细胞的抑制剂筛选，将10 µM的Mpro抑制剂（GC376）和10 µM的PLpro抑制剂（GRL0617）加入到质粒转染的细胞中（图4 g, h, i）。绿色和红色的荧光减少，对应于每个病毒蛋白酶的抑制。以上数据表明，3MBP5可用于成像质粒转染细胞中Mpro和PLpro的细胞内活性，并识别蛋白酶的抑制。
图4 通过质粒和抑制剂验证3MBP5
在确认3MBP5可以在质粒转染的HEK 293T细胞中检测Mpro和PLpro后，作者开始验证3MBP5是否可以在SARS-CoV-2感染的细胞中用于Mpro和PLpro的成像以及筛选其抑制剂。因此，在加入探针之前，用SARS-CoV-2感染TMPRSS2-Vero细胞，感染倍数（MOI）为0.02，持续24小时（图4a）。在感染后24小时，将3MBP5和Hoechst 33258加入细胞中，再孵育30分钟。用2.0 µM 3MBP5培养时，感染细胞中观察到强烈的绿色和红色荧光，而非感染细胞中没有，因此选择2.0 µM 3MBP5用于随后的细胞成像。作者使用抗SARS-CoV-2核衣壳（Capsid）、抗SARS-CoV-2 Mpro一抗和AlexaFluor 488标记的二抗（Alexa488）进行染色，确认细胞的感染。感染的细胞中有明显的绿色（Mpro）、红色（PLpro）和青色（衣壳）荧光，未感染细胞无明显荧光（图5b, c）。这些数据证实了病毒的存在并产生了相关的蛋白酶。有趣的是，大多数Alexa488标记衣壳染色的感染细胞几乎没有Mpro和PLpro信号，并不是所有感染细胞对每种蛋白酶的信号程度都相同。由此可见，Mpro、PLpro和Capsid细胞内蛋白表达水平存在差异。当感染细胞与Mpro一抗、Alexa488和3MBP5孵育时，绿色（Mpro）、红色（PLpro）和青色（Mpro）荧光有很好的重叠，并且它们的荧光强度在细胞间存在差异（图5d）。作者在细胞膜附近还可以观察到一些没有绿色和红色荧光重叠的青色荧光（图5d，粉色箭头）。这是因为3MBP5代表了蛋白酶的活性，而Alexa488标记的Mpro抗体显示了蛋白酶的位置。此外，感染24 h后，作者使用Western blot检测了PLpro、Mpro、衣壳和GAPDH的表达（图5i）。为了进一步评价3MBP5对蛋白酶抑制剂的检测效果，作者将感染细胞与不同浓度的Mpro抑制剂和PLpro抑制剂孵育后加入3MBP5。与GC376孵育后3MBP5的绿色和红色荧光减少（图5f），与GRL0617孵育后3MBP5的红色荧光降低（图5g），说明3MBP5（图5f, g, h）可以检测到Mpro抑制剂和PLpro抑制剂对蛋白酶活性的降低。这些结果证实，3MBP5可用于在SARS-CoV-2感染细胞中同时筛选Mpro、PLpro及其抑制剂。
图5 Mpro、PLpro和抑制剂在SARS-CoV-2感染的TMPRSS2-Vero细胞中的同时显示
综上所述，作者报道了使用双色FRET探针进行SARS-CoV-2 中的Mpro和PLpro的同时检测和细胞内分布研究，对Cy3-BHQ-2、Cy3-Cy5和Cy5-BHQ-2之间的FRET效率进行了理论计算和实验验证，并成功地合成了四种不同的探针。LC-MS和光学实验证实了底物可以被Mpro和PLpro特异性裂解，并同时验证了它们的催化效率。所合成的3MBP5探针可实现受感染的细胞的快速识别，以准确理解涉及多种蛋白酶的复杂生物过程，也可以应用于同时检测不同的蛋白酶，对于快速筛选其他新兴蛋白酶的抑制剂具有重要的应用价值。https://doi.org/10.1002/anie.202113617
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