分享一篇2023年发表在Nat. Methods的文章，文章的题目是“Engineered allostery in light-regulated LOV-Turbo enables precise spatiotemporal control of proximity labeling in living cells”。本文通讯作者是来自斯坦福大学遗传学、生物学和化学的Prof. Alice Y. Ting，其课题组致力于应用蛋白质工程、定向进化、蛋白质组学、化学合成、计算设计和高分辨显微镜开发探测分子和细胞网络的技术，以深入研究线粒体和哺乳动物大脑中的信号。

TurboID由大肠杆菌生物素连接酶（BirA）定向进化而来，是一种用于活细胞中混杂生物素化邻近依赖标记和空间蛋白质组定位的人工酶。TurboID利用生物素和ATP生成活性生物素-AMP混合酸酐，并将其从活性位点释放出来，在亲核性赖氨酸侧链上共价标记附近的蛋白质。虽然TurboID已被广泛用于培养基和活体中绘制蛋白相互作用组和细胞器蛋白质组，但其存在生物素底物可用性控制和空间特异性局限。因此，本文将光响应结构域整合到工程蛋白中，构建了TurboID的光调节变体“LOV-Turbo”。LOV-Turbo在黑暗状态下几乎无法检测到活性，但在微弱的蓝光照射下几秒钟内就会启动，其活性不仅与TurboID相当，还提高了培养基及体内邻近标记的空间和时间精度。

作者通过将LOV感光域整合到TurboID暴露在表面并与其活性位点发生变构耦合的环中，以调节其对光的活性。LOV的核心是一个紧密的复合物，其C-端Jα螺旋处于非活跃状态，当470 nm蓝光照射时LOV释放Jα螺旋使TurboID被激活。为了检验黑暗状态下LOV的夹持效应可以扭曲和损害活性位点，而光照下则释放使其恢复原本的活性构象的假设。作者基于BirA的晶体结构在TurboID中选择了9个不同的表面暴露环，并测试了31个不同的LOV插入位点，其中12个位点完全丧失了TurboID活性，而另外5个的活性在光照和黑暗状态下都受到了损害。鉴于LOV-Turbo对光依赖活性敏感，作者通过去除N-端的氨基酸发现LOV-Turbo的暗活性降低的同时光态活性不受影响，而且±光信号比提高了两倍以上。这种优化的光调节变体LOV-Turbo1在细胞中虽然也有有效，但其表达水平远低于TurboID，这表明它的不稳定性和有限的生物素化水平。

为了改善LOV-Turbo1的表达和稳定性，以及优化其动态范围，作者使用酵母展示平台对LOV-Turbo进行了定向进化，并在光照条件下进行了3轮正向筛选，和2轮黑暗条件下的负向筛选，最后再以37°C进行了2轮额外的阳性选择，以增强筛选出稳定和良好折叠克隆菌株的严格性。7轮筛选后的酵母文库显示出具有比LOV-Turbo1更高的表达和混杂生物素化活性，其中用于HEK293T细胞分析的8个克隆均表现出光依赖性活性。作者随后通过筛选人工重组的突变体，得到了另外13个LOV-Turbo突变型（C1-C13）。与酵母富集的克隆一起测试发现，具有6个TurboID序列突变和无LOV结构域突变的C10比LOV-Turbo1模板具有更高的±光信号比和表达水平。C10的预测结构显示，6个突变分布在整个蛋白中，只有I231V和A166V靠近生物素/ATP底物结合口袋，而其他突变则可能有助于C10表达水平的改善，因此本文将C10作为最终优化的LOV-Turbo。

作者研究LOV-Turbo对光的需求发现1 mW·cm-2的功率下的连续照明是最佳的光控调节。随后，作者在HEK 293T细胞的多个亚细胞区室中探测了LOV-Turbo的性能。通过链霉亲和素免疫印迹，反映了LOV-Turbo在各个位置标记了不同的亚细胞蛋白质组。在细胞质中，LOV-Turbo比TurboID活性更高，而TurboID活性在细胞核和线粒体基质中更高。

为了测试光激活的LOV-Turbo是否可以在无光状态下逆转为非活性状态，作者比较了光照15分钟后关闭的LOV-Turbo与持续光照1小时的LOV-Turbo生物素化活性。结合HEK 293T细胞中LOV-Turbo的开启和关闭动力学研究结果表明，LOV-Turbo是可逆的，能快速开启和闭合。

随后，作者测试了LOV-Turbo是否可以用于其他细胞类型和体内的光依赖型邻近标记。通过细菌或酵母细胞表达LOV-Turbo，并分别用蓝光和100 μM生物素标记都能观察到混杂的生物素化，且活性与TurboID和miniTurbo相当；此外，LOV-Turbo在培养的大鼠皮质神经元中也有活性；最后，作者通过注射含有LOV-Turbo基因的腺相关病毒到成年小鼠的初级运动皮层也测试到了完整小鼠大脑中LOV-Turbo的活性。这些研究成果说明了LOV-Turbo在多种细胞器和细胞类型中的多功能性。

LOV-Turbo提高了邻近标记的时间特异性。当靶向线粒体时，TurboID持续性生物素化活性会使靶向序列中关键赖氨酸残基自动标记，导致构建体错定位到细胞核，并催化核蛋白的背景生物素化。相比之下，相同的环境下的LOV-Turbo可以正确靶向线粒体并产生特异性生物素化。为了证明LOV-Turbo邻近标记的空间控制，作者对部分覆盖的细胞培养皿进行了光照，并观察到了链霉亲和素染色只出现在未覆盖的样品照明区域。

LOV-Turbo也能应用于脉冲追踪标记。因为光能可逆地调节LOV-Turbo，光的去除可以终止生物素化。当进行10 min的LOV–Turbo生物素化标记蛋白质组后，在黑暗中继续培养细胞并追踪8小时，观察到细胞质中重新分布的生物素化蛋白。LOV-Turbo的脉冲追踪标记可以与细胞器分级相结合，以追踪重新分布到特定细胞器中的生物素化蛋白。作者用LOV-Turbo-NES标记HEK 293T细胞的细胞质蛋白质组，捕获到包括importin-α和HSP70在内的一系列蛋白质。

LOV-Turbo还能基于荧光素酶生物发光产生的生物发光共振能量转移(BRET)构建LOV光遗传工具。作者首先将荧光素酶NanoLuc直接融合到LOV-Turbo上，测试了NanoLuc底物与生物素在黑暗中作用时，LOV-Turbo可以被BRET激活，并在HEK 293T细胞中观察到生物素化。然后，作者利用捕集蛋白在GPCR CCR6的肽激动剂CCL20激活后的招募效应，测试了分子间的BRET结构。结果显示在呋喃马嗪和生物素存在的情况下，使用CCL20激动剂处理的细胞可以通过捕集蛋白-LOV-Turbo进行混杂生物素化，而未处理的细胞中则没有。因此，结合使用LOV-Turbo和NanoLuc使标记活细胞中特定蛋白亚复合物的相互作用组成为可能。

通过进行两组基于定量液相色谱-串联质谱（LC-MS /MS）的蛋白质组学实验，作者进一步探索了在活细胞中使用LOV-Turbo进行脉冲追踪标记。第一项研究应用LOV-Turbo标记来自细胞质表面的内源性内质网膜(ERM)相关蛋白质组，使用TMT标记检测到5308个蛋白，进行P值、差异倍数等一系列过滤后得到29个蛋白列表，其中，20个蛋白具有分泌途径注释，15个蛋白具有核注释，7个蛋白具有核和分泌注释。在第二个蛋白质组学实验中，作者将ERM上的LOV-Turbo标记与线粒体分离相结合，LC-MS /MS共检测到5107个蛋白，重复样本间的相关性良好。经过滤筛选后分别获得了在基础和毒胡萝卜素应激条件下从内质网转运到线粒体的16和64个蛋白质列表，这两个列表都富含内质网和分泌通路注释蛋白。

通过结构导向设计、筛选和定向进化的结合，本文开发了一种可逆的邻近标记酶TurboID的蓝光门控变体LOV-Turbo。LOV-Turbo具有极宽的动态范围，提高了邻近标记的空间和时间精度，并实现了TurboID无法实现的新应用，包括脉冲追踪标记绘制生命系统中的蛋白质组动力学。此外，本文的研究展示了一种具有极高动态范围的工程型光诱导变构的半理性方法，可以应用于其他感兴趣的酶。