分享一篇摘自JACS的文章“Live-Cell RNA Imaging with Metabolically Incorporated Fluorescent Nucleosides”荧光成像是一种探测生物系统中大分子动力学的强大策略，然而，目前细胞内RNA成像的方法仅限于研究单个RNA或与固定样本兼容的批量RNA标记。本文作者开发了一个平台，用于活细胞中总体的RNA动力学标记。

RNA在生物学中起着核心作用，探索其动态行为对于阐明基本生物过程背后的机制至关重要。目前，活细胞中RNA动态可视化的方法主要集中在单个转录本的成像上。研究细胞RNA动力学的一种补充方法是将修饰的核苷掺入细胞RNA中。含有炔、叠氮化物、或乙烯基功能的修饰嘧啶和嘌呤核苷通过核苷酸挽救途径掺入RNA，然后使用生物正交化学荧光染料标记，达到RNA的可视化。另一种方法是荧光核苷的直接代谢掺入，包含多个修饰核苷的RNA转录本的荧光超过单个修饰核苷或核苷酸的荧光背景。这种策略能够实现全局转录组动力学的活细胞RNA成像，但不需要RNA掺入。

此前，作者发现尿苷−胞苷激酶2(UCK2)的磷酸化是c5修饰的嘧啶核苷代谢掺入的瓶颈，但该激酶的突变形式的表达使5-叠氮甲基尿苷（5-AmU）通过代谢途径标记RNA成为可能。作者首先选择并评估了一组荧光嘧啶核苷，命名为PyrroloC, tC, MeOtC和 DEAtC。接下去作者评估荧光核苷是否可以被并入活细胞的代谢途径。用荧光核苷孵育天然HeLa细胞，不能检测到荧光；但在HeLa T-Rex Flp-In UCK2细胞（诱导野生型或Y65G突变体UCK2表达），观察到很强的荧光标记。并进一步通过两种互补的分析方法证明细胞荧光是吡咯loc和tC的RNA掺入。这些结果说明过表达核苷激酶UCK2，可以实现荧光核苷pyrrolo C和tC的高效代谢RNA标记。

为进一步了解UCK2在大量荧光核苷掺入细胞RNA这一过程中的作用，作者研究了核苷的磷酸化。在用UCK2处理 1小时后，作者观察到pyrroloC完全磷酸化，tC磷酸化42%。而结合不良的胞苷类似物在体外显示出极小的磷酸化，^DEAtC没有磷酸化，1小时后^MeOtC只有极小的磷酸化。

氧化应激诱导细胞生理的一些变化，伴随着翻译和转录程序的改变，但氧化对整体RNA动力学的影响仍然知之甚少。接着，作者使用tC RNA标记来研究氧化应激过程中RNA的整体合成和周转。为此，作者在NaAsO₂诱导的氧化应激过程中使用tC核苷进行了代谢标记，并在开始喂食和应激后的多个时间点进行了细胞成像。在NaAsO₂胁迫下，tC荧光在处理的第一个小时增加，但随后的1小时到4小时稳步下降；在非应激细胞中，RNA中tC的积累在4小时内持续增加。对NaAsO₂处理后的RNA定位的进一步分析表明，早在应激诱导后1小时就形成了细胞质RNA聚集点，这些聚集点仅在tC喂养过程中施加NaAsO₂应激时存在。通过活细胞成像、发现这些聚集点与DDX6-mCherry共定位。综上，作者的研究结果表明，NaAsO₂胁迫过程中产生的一个RNA转录本与DDX6一起聚集在细胞质病灶中。这些病灶不同于典型的应激颗粒和p-小体，可能含有rRNA。