分享一篇发表在《Journal of the American Chemical Society》期刊的文章“Live-Cell RNA Imaging with Metabolically Incorporated Fluorescent Nucleosides”。通讯作者是来自美国耶鲁大学的Byron W. Purse和Ralph E. Kleiner。
背景介绍
RNA在生物学中起着核心作用，探索其动态行为对于阐明基本生物过程的机制至关重要。荧光显微镜是研究细胞RNA生命周期(包括其转录、运输和衰变)的有力方法。目前用于可视化活细胞中RNA动态的方法主要集中于对单个转录物进行成像，譬如使用MS2-MCP系统的标记方法、荧光RNA适配体特异性标记以及利用CRISPR-Cas系统靶向目标物进行成像。这些活细胞RNA成像方法，但仅限于分析单个转录本，通常需要添加非天然RNA序列标签。细胞生物学研究的补充方法RNA动力学是将修饰的核苷并入细胞RNA。这些活细胞RNA成像方法提供了重要的生物学见解，但仅限于分析单个转录本，并且需要添加非天然RNA序列标签。
作者提出了一种新的方法，将荧光核苷通过代谢途径直接掺入细胞中，通过尿苷胞苷激酶2（UCK2）由于该策略在RNA掺入和荧光反应后不需要荧光团标记，反应含有多个修饰核苷的RNA转录本的荧光背景应超过单个修饰核苷或核苷酸的荧光背景，这应使活细胞RNA成像能够反映整体转录组动力学。作者设计了四种具有荧光性质的核苷类似物，并对其光谱性质进行了测定（图1）。
接下来，作者对荧光核苷是否可以整合到活细胞中进行了验证。他们构建了四环素诱导启动子(FIp-In) 控制下稳定表达UCK2的HeLa细胞和瞬时转染合适DNA质粒表达UCK2的HeLa细胞，并对结果进行验证。结果表明，两种UCK2表达系统比内源性UCK2表达水平高7-11倍（图2）。作者利用UCK2酶可将尿苷和胞苷磷酸化这一机制，尝试将结构上与尿苷类似的荧光核苷类似物磷酸化并掺入细胞新合成的RNA中。为了测试核苷掺入效果，使用每种荧光核苷处理细胞12小时，然后通过荧光显微镜细胞进行成像。观测结果表明，tC和PyrroloC可由野生型（WT）UCK2或Y65G UCK2突变体催化掺入细胞合成的RNA中，而WT型UCK2存在的细胞中产生了更强的荧光。荧光信号集中在细胞核中，但也在细胞质中发现，与RNA合成的分布一致。其次，作者从UCK2细胞或瞬时转染UCK2的细胞中诱导的HeLa T-Rex FIp中分离总细胞RNA，并在消化和去磷酸化核苷后进行LC-QQQ-MS分析(图4)。结果显示，在任意表达系统中WT或Y65G UCK2激酶的过度表达均会导致PyrroloC的RNA掺入增加约20至100倍（图5），在稳定表达诱导型WT-UCK2的细胞出现最高水平的PyrroloC标记(1.1+0.02%的C)。同时也可观察到，在表达WT UCK2或Y65G UCK2的细胞中，tC标记的RNA增加了约4至8倍，但是其总的掺入水平略低于PyrroloC(图5)。
图4. 验证荧光核苷掺入实验过程图
图5. tC和PyrroloC在两种表达系统中的表达情况为了进一步理解荧光核苷的掺入对于细胞RNA的影响和UCK2酶在此过程中发挥的作用，作者使用HPLC技术在体外测定荧光核苷的磷酸化速度。在WT UCK2存在时，观察到在所测定的条件下，UCK2在1小时内使PyrroloC完全磷酸化和tC 42%磷酸化（图6. A和B）。而在相同的反应条件下，尿苷在5分钟内完全磷酸化。但MeOtC仅出现最小的磷酸化(<20%) ，DEAtC几乎没有磷酸化。上述结果表明，双环和三环荧光胞苷类似物在细胞RNA中的掺入效率与其被UCK2磷酸化的能力密切相关。随后作者团队尝试在活细胞内使用荧光核苷进行成像，并对细胞氧化应激过程中整体RNA的合成过程进行探究。为了研究应激条件下的RNA动力学，他们使用tC RNA标记来研究亚砷酸钠诱导的氧化应激期间的细胞内RNA合成，并在加入tC和应激后的多个时间点对细胞进行成像。可观察到，在处理的第一个小时内， 细胞荧光强度增加，但在亚砷酸钠处理的1至4小时内，荧光强度稳定下降（图8)）。相反，在4小时内，非应激细胞中RNA中的tC积累持续增加。由于NaAsO2处理可同时影响RNA合成和降解，作者接下来进行了脉冲追踪标记实验。将细胞在tC条件下孵育4小时，然后在存在或不存在NaAsO2的无tC培养基中培养30分钟。在含NaAsO2的培养基中，来自tC标记RNA的荧光信号强烈减少(55%) ，而非应激细胞中tC标记RNA水平仅减少18%(图8)。综上所述，在NaAsO2胁迫下，RNA降解速度增加。此外，结果中发现核仁RNA定位改变，这表明氧化应激影响rRNA合成和/或加工。在这篇手稿中，作者开发了一种在活细胞中进行全转录组RNA成像的策略。通过共聚焦荧光显微镜和LC-QQQ-MS显示，UCK2的过表达使通过代谢途径对RNA进行荧光核苷标记成为可能。与之前依赖叠氮化物或炔烃修饰核苷的代谢途径标记，然后与合适的反应性荧光团进行生物正交连接的方法相比，这种策略在操作上更简单，与活细胞成像兼容，更不容易出现由细胞固定和/或渗透和洗涤条件引起的背景。整合核苷化学、蛋白质工程和代谢标记将为探索RNA在其天然生物学背景下的动态行为带来独特的研究方向。
本文作者：Kevin.G
审核：RongXX
论文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.2c04142
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