分享的是一篇发表在JACS上的文章Live-cell RNA imaging with metabolically incorporated fluorescent nucleosides，文章的通讯作者是普林斯顿大学化学系Ralph E. Kleiner教授和圣地亚哥州立大学化学与生物化学系Byron W. Purse教授。
荧光成像是探测生物系统大分子动力学的一种有力方法；然而，细胞RNA成像的方法仅限于研究单个RNA结构或主要与固定样本兼容的批量RNA标记方法。在本文中，作者开发了一个用于活细胞中批量RNA动力学的荧光成像平台。他们表明，荧光双环和三环胞苷类似物可以通过尿苷-胞苷激酶2的过表达而被代谢掺入到细胞RNA中。特别是，将代谢孵育三环胞苷衍生的核苷tC与共聚焦成像相结合，能够实现单细胞分辨率研究RNA合成、降解和转运。利用他们的成像模式来研究氧化应激反应过程中RNA代谢和定位，发现NaAsO2处理大大加快了批量RNA周转。此外，他们确认了在氧化应激过程中产生的细胞质RNA颗粒包含RNA转录本，并通过与RNA解旋酶DDX6共定位，表明不同于典型的应激颗粒和P-小体。总之，他们的工作为活细胞RNA成像提供了一种强大的方法，并揭示了细胞如何重塑RNA转录组动力学以应对氧化应激。
RNA在生物学中发挥着重要作用，探索其动态行为对阐明基本生物学过程的机制至关重要。荧光显微镜是研究细胞RNA生命周期（包括其转录、运输和衰变）研究细胞RNA生命周期（包括其转录、转运和降解）的一种强有力的方法。目前用于可视化活细胞中RNA动力学的方法主要集中在对单个转录本进行成像，这可以通过多种方式实现。Singer和他的同事开发了MS2标记，该技术利用病毒MS2茎环序列将绿色荧光蛋白(GFP)——融合蛋白招募到感兴趣的RNA，在过去30年里一直是活细胞RNA成像的黄金标准。最近，荧光RNA适体和 CRISPR-Cas靶向策略提供了一种补充的方法来对细胞中的单个RNA序列进行成像。此外，可以用合成荧光团对体外生成或从细胞中纯化的RNA进行化学酶修饰，然后再将其引入细胞。 这些活细胞RNA成像方法提供了重要的生物学见解，但仅限于分析单个转录本，通常需要添加非天然RNA序列标签。研究细胞RNA动力学的另一种补充方法是将修饰的核苷掺入到细胞RNA中。作者和其他研究者已经报道，含有炔烃、叠氮化物、或乙烯基官能团修饰的嘧啶和嘌呤核苷可以通过核苷酸补救合成途径整合到RNA中，使用生物正交化学方法用荧光染料进行标记，可实现完整细胞和生物体中的RNA可视化。部分依赖于核糖核苷结构，代谢标记的驱动力在于其简单性和全转录组的普遍性。对核苷结构干扰最小的叠氮化物/炔烃修饰可以被核苷酸补救合成途径接受并整合到活细胞RNA中。然而，这些代谢掺入的生物正交核糖核苷的成像主要在固定好的细胞或组织切片中进行。这主要是因为荧光标记依赖于Cu(I)催化叠氮-炔烃环加成(CuAAC)，而这与活细胞不兼容，并且需要“清楚”用于驱动标记反应完成的过量未反应染料。虽然这些方法很强大，但生物正交标记方案可能会由于固定和透化方法或由于荧光染料与细胞结构的非特异性结合而引入偏差，因此，尚不清楚这些方法是否准确捕获所有细胞RNA的画面。在少数情况下，张力促进的叠氮化物-炔烃环加成 (SPAAC) 化学已被用于在活细胞中用荧光染料标记叠氮修饰的RNA，然而，该反应的动力学缓慢，需要细胞可渗透的荧光染料，并且难以去除多余的荧光团，使其对细胞内目标的应用具有挑战性。使用生物正交核糖核苷酸对RNA进行成像的两步过程的替代方法是荧光核苷的直接代谢掺入（图 1a）。由于这种策略在RNA掺入后不需要荧光团标记反应，并且含有多个修饰核苷的RNA转录本的荧光理应超过单个修饰核苷或核苷酸的荧光背景，因此它应该能够实现全转录组动力学的活细胞RNA成像。事实上，已经报道了大量的荧光核苷类似物，然而，这些结构主要用于体外应用，并通过化学合成或体外转录掺入RNA，目前尚不清楚它们是否是代谢掺入到RNA中的合适底物。
之前，作者证明了尿苷-胞苷激酶2 (UCK2)的磷酸化是C5修饰的嘧啶核苷代谢掺入的瓶颈，而该激酶突变形式的表达能够用5-叠氮甲基尿苷(5-AmU)进行代谢标记。本文中，作者评估了一系列荧光胞苷类似物的体外磷酸化和RNA代谢掺入。他们证明UCK2在细胞中的表达有助于pyrrolocytidine (pyrroloC)和1,3-diaza-2oxophenothiazine (tC)荧光核糖核苷对RNA的标记。此外，他们使用UCK2系统结合tC孵育和共聚焦显微镜来测量正常和应激条件下活细胞的RNA转录、周转和转运。他们揭示了氧化应激对RNA代谢的影响，并确定了一种新的应激依赖性RNA蛋白颗粒的形成。总之，他们的工作为活细胞RNA成像提供了一种通用方法，并揭示了细胞 RNA 在氧化应激反应期间的时空动态。
D. Wang, A. Shalamberidze, A. E. Arguello, B. W. Purse, R. E. Kleiner, J. Am. Chem. Soc.2022. ASAP.
原文链接：
https://doi.org/10.1021/jacs.2c04142
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