介绍一篇2020年发表在JACS上的文章，题目为“Cell- and polymerase-selective metabolic labeling of cellular RNA with 2'-azidocytidine”。文章提出了基于2’-叠氮基胞苷（2’-AzCyd）-脱氧胞苷激酶（dCK）的细胞和聚合酶选择性的RNA代谢标记策略，并用于分析由氧化应激或者mTOR抑制引起的核糖体自噬过程中核糖体RNA的转化。文章通讯作者是来自美国普林斯顿大学化学系的Ralph E. Kleiner助理教授，他们课题组致力于破译细胞RNA的化学复杂性，主要研究内容包括修饰核酸的合成、化学蛋白质组学和定量细胞成像等。代谢标记是一种研究细胞RNA生物学的有效方法。特别是，生物正交反应标签、光亲和标签或产生特征突变的修饰核苷酸可用作研究活细胞中转录动力学和蛋白质-RNA相互作用的化学探针。目前，使用最为广泛的修饰核苷酸包括4-硫代鸟苷（4-SU）和5-乙炔基鸟苷（5-EU）等，它们可以被细胞高效摄取并激活。目前，已报道的修饰核苷在代谢标记细胞RNA时具有一定的细胞毒性，并且缺乏细胞和聚合酶选择性。2’-叠氮基核糖核苷已经成为生物正交标记细胞RNA。其中，2’-叠氮基腺苷（2’-AzAd）主要依赖polyA聚合酶代谢标记到细胞RNA中。但是，基于2’-叠氮基嘧啶核苷的细胞RNA代谢标记的相关研究和应用还很少。有研究表明，2’-叠氮基尿苷（2’-AzUrd）是一种标记效率差的代谢标记底物，但可用于选择性地标记过表达尿苷-胞苷激酶2（UCK2）的细胞RNA。另有研究表明，只有很少量的2’-叠氮基胞苷（2’-AzCyd）可以被代谢标记到细胞RNA中。基于此，本工作进一步研究了2’-AzCyd代谢标记细胞RNA的机制及应用。作者分别用1 mM 2’-AzAd、2’-AzUrd和2’-AzCyd培养HeLa细胞6小时（图1A），然后利用CuAAC以及荧光成像技术来评估2’-AzCyd标记细胞的情况。结果如图1B所示，细胞能够高效地摄取2’-AzAd；细胞能摄取2’-AzCyd，但强度小于2’-AzAd；没有观察到细胞明显地摄取2’-AzUrd。作者发现2’-AzCyd可以标记细胞核与细胞质，且核仁染色强烈。为了进一步确认是RNA标记，作者考察了放线菌素D（一种RNA酶抑制剂）和羟基脲（一种DNA合成抑制剂）对2’-AzCyd代谢标记细胞的影响。如图1C所示，放线菌素能够抑制2’-AzCyd的代谢标记，而羟基脲没有明显的干扰。上述结果说明2’-AzCyd可以代谢标记到细胞RNA中。
图1（A）嘧啶核苷及2’-AzCyd的代谢途径；（B）2’-AzCyd，2’-AzUrd和2’-AzAd代谢标记HeLa细胞；（C）放线菌素D和羟基脲对2’-AzCyd代谢标记HeLa细胞的影响。
核基质蛋白的磷酸化被认为是嘧啶核苷代谢的速度决定步骤。为了确定2’-AzCyd代谢标记细胞RNA的机制，作者考察了两种已知激酶：尿苷-胞苷激酶2（UCK2）和脱氧胞苷激酶（dCK）对2’-AzUrd和2’-AzCyd磷酸化的影响。如图2A所示，HPLC实验结果表明，dCK能够高效地介导2’-AzCyd发生磷酸化，且活性明显高于UCK2。此外，两种激酶不能使2’-AzUrd发生磷酸化（图2B）。作者还发现2’-AzCyd被dCK磷酸化的速度比其天然底物脱氧胞苷更快（图2C）。上述结果说明dCK可能是介导2’-AzCyd掺入细胞RNA的主要激酶。
图2（A）HPLC分析dCK和UCK2介导2’-AzCyd发生磷酸化的能力；（B）定量分析dCK和UCK2介导2’-AzCyd和2’-AzCyd发生磷酸化的能力；（C）dCK和UCK2介导2’-AzCyd和Cyd发生磷酸化的速度。
作者通过上述结果推测dCK酶的过表达可能会增加2’-AzCyd的标记，为细胞特异性标记提供途径。为了验证这一点，作者用dCK质粒转染HeLa细胞，并用1 mM 2’-AzCyd处理，同时也处理了未转染细胞和转染了UCK2质粒的细胞（图3A）。处理后，细胞使用CuAAC化学成像来检测2’-AzCyd的标记。结果表明，dCK过表达使2’-AzCyd标记大幅增加（图3B），而且相对于对照细胞，过表达UCK2也增加了少量标记。作者接着也研究了过表达dCK和UCK2对2’-AzUrd的标记。结果表明，dCK过表达没有增加2’-AzUrd的标记，而UCK2只有非常少量的增加（图3C），与无法在体外检测核苷磷酸化的结果是一致的。
图3 dCK介导2’-AzCyd标记。（A）2’-叠氮嘧啶标记流程。（B）和（C）分别为转染FLAG标记的UCK2或dCK编码质粒的HeLa细胞用1mM 2’-AzCyd或1mM 2’-AzUrd处理6小时。
为了进一步了解2’-叠氮嘧啶的标记，作者使用定量核苷LC-MS/MS测量总RNA的修饰水平。细胞加入2’-AzCyd或2’-AzUrd 12小时后，分离总RNA，通过酶切后用LC-QQQ-MS定量。定量结果与成像结果一致，dCK过表达显著增加了2’-AzCyd的标记水平（相对于对照细胞增加4.3倍），最终相对于未修饰的胞苷为0.3%（图4）。UCK2过表达也增加了2’-AzCyd的标记，但与对照细胞相比增加的幅度较小。此外，作者也研究了2’-AzUrd的标记。在对照组和转染dCK的细胞中，无法在总RNA中检测到2’-AzUrd。然而，在转染UCK2后，可以测量到0.03%的标记率（图4），比使用dCK过表达系统的2’-AzCyd标记低大约10倍。图4 2’-叠氮嘧啶标记HEK293T细胞RNA（LC-MS/MS分析消化后总RNA）。在验证了dCK-2’-AzCyd作为一种强大的代谢标记策略后，作者进一步通过含有可诱导dCK的稳定HeLa细胞系在细胞RNA中对2’-AzCyd标记进行了表征。作者分离了总RNA和带有polyA标签的RNA，使用了SPAAC化学和凝胶电泳对含2’-AzCyd的RNA进行了分析。结果表明，2’-AzCyd的积累主要发生在28S和18S大rRNA以及可能由5S RNA、tRNA和其他小的非编码RNA（图5A），与观察到的2’-AzAd标记模式不同，2’-AzCyd通过polyA聚合酶进入细胞mRNA。作者进一步研究了不同特异性的小分子RNA聚合酶抑制剂存在时的2’-AzCyd标记。与凝胶电泳结果一致，2’-AzCyd标记被RNA聚合酶I特异性抑制剂放线菌素D强烈抑制了，但在RNA聚合酶II特异性抑制剂α-鹅膏蕈碱存在时不受影响（图5B）。最后，为了证明RNA聚合酶I特异性标记过程，作者在dCK过表达细胞中使用2’-AzCyd进行脉冲追踪实验，以研究不同条件下的rRNA转化。脉冲标记后，2’-AzCyd标记在追踪12-24小时内下降（图C和D）。由于这个时间点与HeLa细胞加倍的时间相似，信号的减少主要是由于细胞分裂时的稀释，而不是rRNA的降解，这与之前报道的长rRNA半衰期一致。相比之下，当细胞被mTOR抑制剂雷帕霉素处理或亚砷酸钠（可以诱导核糖体自噬）处理时，从3-6小时左右开始信号下降的速度要快得多（图5E和F），表明rRNA降解加速。
图5 2’-AzCyd主要标记rRNA。（A）2’-AzAd和2’-AzCyd标记的凝胶分析。（B）dCK过表达HeLa细胞在放线菌素D或或鹅膏蕈碱存在时2’-AzCyd的标记。（C）2’-AzCyd标记RNA在HeLa细胞中的转化。用1 mM 2’-AzCyd脉冲细胞12小时，并在完全培养基中追踪。（D）、（E）和（F）核糖体自噬过程中2’-AzCyd RNA的转化：（D）未处理，（E）500 nM雷帕霉素，（F）50 μM NaAsO2
在这项工作中，作者开发了2’- AzCyd-dCK对作为细胞和聚合酶特异性的强有力的RNA标记策略。与其他核苷酸相比的RNA标记，这个工作有几个优点。首先，叠氮核苷是耐双正交化学的SPAAC，不会导致RNA降解。其次，2’-AzCyd的毒性比通常使用的核糖核酸苷类似物4-SU要小，可有效标记到细胞RNA中，从而可以在不富集的情况下对标记的RNA进行功能分析。此外，作者证明2’-AzCyd主要被RNA Pol I所利用，与其他可用探针相比，它提供了一个独特的标记图谱。最后，尽管大多数细胞RNA功能化的方法都集中在碱基修饰上，该研究表明，脱氧核苷回收和RNA聚合酶之间存在独特的协同作用，可以利用这种协同作用来替代核糖2’-OH，为用不同化学基团标记细胞RNA以探测生物过程提供了新的机会。原文链接：https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/jacs.0c04566
目前评论：