给大家介绍一篇来自“Bioconjugate Chemistry”上的文章，题名为“Covalent and Oriented Immobilization of Antibodies through Systematic Modification of Photoactivatable RNA Hybrid Aptamers “在这篇文章中，该课题组报告了一种用于通过紫外线 (UV) 照射定向共价固定抗体的 Fc 结合 RNA 适配体 (FcBA) 的新方法。他们合成了几种类型的光不稳定 FcBA，它们与几种不同的光活化官能团结合，并研究了它们与抗体的光交联能力。他们还展示了 FcBA 的各种结构变体，以提高对人 IgG 的光交联能力，并证明了它们在固体基质上的适用性。

功能化 Fc 结合适体的设计

他们设计了几种可光激活的 Fc 结合适体 (FcBA)，它们可以与抗体的 Fc 区进行定点光交联。他们从之前公开的基本条件中考虑了几个关键点，为了不干扰原始的 Fc 结合能力，并将一些碱基改变为硫醇基团，如下所示。适体的 GGUGCU 凸出环对（包含第 4 至第 9 个核苷酸）及其相邻结构似乎对 Fc 结合能力至关重要。因此，他们初步选择了四个内部位置进行修饰（从 5'-末端开始的第 2、12、13 和 19 个），并将它们中的每一个都替换为硫醇修饰的核苷酸。

图1

检查功能化 FcBA 的抗体结合能力

为了研究 FcBA 变体的抗体结合能力，使用链霉亲和素修饰的磁珠进行下拉测定。移植到链霉亲和素珠上的生物素化 FcBA（表 S1）在随后与人 IgG 孵育时几乎不影响 Fc 结合能力。主要的两种类型的条带（考马斯亮蓝）代表来自回收的人 IgG 的重链（~50 kDa）和轻链（~25 kDa）的条带，及其通过 FcBA 珠的 Fc 结合能力。通过比较原始适配体（A0，泳道4）与其他四种FcBA（A1至A4，泳道5至8）之间的条带强度来相对评估FcBA结合能力。他们成功地证实了 A1、A2、分别在第 2、12 或 13 位进行单核苷酸置换后，A3 和 A3 的结合亲和力不低于 A0。

图2

光激活 FcBA 与抗体的光交联效率

为了追踪光交联效率，6-FAM 修饰的 FcBA 进一步用可光活化化合物进行标记。尽管几乎等量的抗体（在紫外线照射之前）与每个 FcBA 结合，还观察到显着不同的光交联效率，以及一个碱基差异。这表明较小的空间距离可能会导致光交联效率的急剧变化。将 P 2、P 3和 P 4引入 FcBA 旨在改变光反应性以增强交联，从而提供柔性间隔物 (P 2 )、附加范围 (P 3 ) 或疏水性 (P 4 ) 以了解其与 Fc 区疏水袋结合相互作用的可能性。然而实验表明，P _{x s} 中的二苯甲酮 (P 1 )似乎是首选的可光活化化合物。

图3

最后，他们优化与抗体的 Fc 选择性和共价偶联，并通过稳定其独特的二级结构来提高抗体和适体之间的光交联效率。作为实际演示，已为扫描免疫芯片制造了固体基质上的定向抗体阵列，并显示出前所未有的抗体层稳健性；亲和层在用含有强洗涤剂 (SDS) 的缓冲溶液剧烈洗涤后可以幸存下来。此外，他们通过适配体序列的多聚化和结构调制对亲和力增强进行了代表性研究。

总之，他们开发了一种新的共价固定策略，用于使用光不稳定的 Fc 结合 RNA 杂交适配体的定向抗体。光不稳定的化合物被整合到原始的 Fc 特异性序列中，以实现与未修饰的天然抗体的有效和共价交联。这种前所未有的基于寡核苷酸的共价定向抗体固定化将为靶向治疗和诊断中的广泛应用提供多功能工具。

作者：YXQ

责编：FJY

原文链接; https://doi.org/10.1021/acs.bioconjchem.2c00274