为大家带来的文献是发表在Chemical Science上的“Live-cell RNA imaging using the CRISPR-dCas13 system with modified sgRNAs appended with fluorescent RNA aptamers”通讯作者是来自武汉大学化学与分子科学学院的周翔教授。

摘要

活细胞中RNA成像策略的发展对于提高我们对其在各种细胞功能中的作用的理解至关重要。作者报道了一种基于活体细胞sgRNA (CasFAS)荧光RNA适体的CRISPR-dPspCas13b系统的高效RNA成像方法。该方法使用修饰过的sgRNA连接到荧光RNA适体上，荧光背景荧光减弱。这提供了一种简单、灵敏的方法，以高精度和高效率成像和跟踪内源性RNA。此外，可以通过用洗涤和抑制操作来改变活细胞中的氟染料类似物，来进行颜色的切换。CasFAS与正交荧光适体(如Broccoli和Pepper)兼容，可实现多种颜色RNA标记或细胞内RNA-RNA相互作用成像。最后，作者利用CasFAS实现了发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)的可视化，为该病毒的进一步研究提供了依据。

研究背景

RNA的时空定位与其细胞功能有关；因此，需要RNA成像方法来揭示它们的位置和动态。虽然荧光原位杂交(FISH)在检测和定量固定 细胞中的RNA分子方面是有效的，但开发其他技术来可视化活细胞中的RNA仍然是需要的。MS2-MCP系统和分子信标的茎环标记最常用于细胞内RNA的可视化。然而，将多重适配体序列与目标转录本融合需要繁琐的遗传操作，这可能会干扰标记RNA的结构和功能，阻碍其在RNA跟踪方面的广泛应用。最近，基于各种技术的聚类规则间隔短回文重复序列(CRISPRs)已经扩展到活细胞中的RNA成像。CRISPRS在基因编辑和调控方面的优异性能表明其精确的核酸靶向能力，使失活Cas (dCas)蛋白能够高效地成像RNA。例如，除了识别和可视化双链DNA外，dCas9和单导向RNA (sgRNA)的复合物还可以通过人工的原间隔相邻基元(PAM)寡核苷酸来稳定靶RNA，这已被探索用于跟踪高丰度mrna的体运动，并观察其在应激颗粒中的积累。其他几个CRISPR-dCas9成像系统也被开发用来标记和跟踪RNA，但依赖PAM序列仍然是CRISPR-dCas9系统用于RNA研究的一个显著限制。一种靶向核糖核酸酶的单链RNA (ssRNA)家族，CRISPR-Cas，提供了一种更直接有效的方法来研究不产生PAM的内源性RNA转录物。Cas13可以被编程降解转录组中独特的RNA序列，催化失活的Cas13 (dCas13)可以融合到一系列效应域，以执行RNA序列特异性操作，如A-to-I编辑、调制翻译或剪接。先前的研究证实，CRISPR-Cas13系统可以与荧光蛋白融合，实现实时RNA成像和跟踪，为实时RNA成像提供了一套有前途的新工具细胞。然而，这意味着需要绑定和跟踪具有足够数量的序列重复或聚合多重副本的RNA。

荧光RNA适体具有荧光染料，在结合时发出荧光，是活细胞RNA成像的有力工具。细胞渗透性化学试剂的荧光开启反应使RNA检测具有高信噪比(SNR)，以突出RNA适体的位置。尽管发射范围从青色到红色的许多荧光RNA适体已经被开发出来，但该方法需要在感兴趣的RNA中插入数十个外源性发夹，类似于MS2-MCP系统，提高了使用该系统研究内源性RNA的能力。据报道，荧光RNA适体修饰的Cas9和sgRNA可以标记基因组DNA，但这种修饰在dCas13系统中还没有被证明是可行的。

在这里，作者假想用荧光RNA适配体标记CRISPR-dCas13 sgRNA，可以结合dCas13系统精确识别RNA的优势和低背景荧光适配体的优势，实现更高效的RNA可视化。与dCas13直接与荧光蛋白融合的策略相比，这种方法可能有几个优点。首先，先前有研究报道sgRNA高度不稳定，在细胞环境中不与靶核酸结合而迅速降解，这可能会消除未结合的sgRNA-荧光适应体共轭物诱导的背景荧光。其次，对于多重颜色检测或同时进行RNA标记，以往基于dCas13的方法需要不同的dCas13正交正交物，由于Cas蛋白体积大，可能不利于细胞转染。此外，到目前为止，在目前的dCas13同源物中，只有dPspCas13b和dPguCas13b表现出可靠的RNA成像效率，为多重检测策略提供了选择。在作者团队的设计中，不同种类的荧光RNA适体，如Spinach、Broccoli或Pepper(具有一系列从青色到红色的荧光团)，可以连接到sgRNA上，只使用一种类型的dCas13蛋白，就可以同时进行多色RNA成像。此外，与传统的荧光RNA适体检测相比，不需要对目标RNA进行基因操作。dcas13-适配体修饰的sgRNA-靶向RNA复合体的稳定性可以提供持久的RNA标记和成像效果。

因此，作者介绍了一种基于dPspCas13b系统的高效活细胞RNA成像方法，通过修饰sgRNAs附加荧光RNA适配体，命名为CasFAS (CRISPR-dCas13系统，sgRNA中带有荧光RNA适配体)。该方法易于编程，创伤小，具有高灵敏度和精确的瞄准效率。此外，具有多色荧光RNA适体的易于调节的sgRNA支架为活细胞中内源性未标记RNA转录物的同时可视化提供了额外的优势，允许扩展应用，如检测RNA-RNA相互作用。

图1.结合荧光RNA适体与sgRNA的CRISPR-dPspCas13b系统 (CasFAS)体的构建

主要研究成果

首先作者设计了修饰sgRNA，并做了体内优化作者选择了著名的荧光RNA适体Broccoli进行初步研究。Broccoli适体可以结合并激活非荧光DFHBI-1T发出绿色荧光。首先，将sgRNA支架在3'端与两个串联的Broccoli适体(2 xBroccoli)融合，命名为sgRNA-3'-2xBroccoli。在没有dPspCas13b的情况下，2 x Broccoli修饰的sgRNA的荧光太低，在细胞内无法检测到，这表明在没有dPspCas13b/sgRNA复合物形成的情况下，单独的sgRNA是极其不稳定的。相反，在成功表达的dPspCas13b蛋白的存在下，观察到明显的荧光信号。这可能是由于与dCas13蛋白结合后，sgRNAs的丰度提高，其稳定性得到了提高，RT-qPCR分析进一步证实了这一点，与之前的报道一致。

接下来，作者通过另外两种方式研究了sgRNA支架与RNA适配体之间的连接模式。一个叫做sgRNA-3'-F-2 x Broccoli，包含sgRNA和2x Broccoli之间的连接子序列；二是将2x Broccoli序列插入sgRNA的环区，命名为sgRNA- in2 x Broccoli。通过比较适配体修饰的sgRNA的绿色荧光和融合红色荧光蛋白(RFP)的dPspCas13b的红色荧光的共定位，作者发现没有连接子序列的sgRNA-3’-2 x Broccoli的荧光信号和共定位并不令人满意。相反，sgRNA-3'-F-2 x Broccoli和sgRNA- in -2 x Broccoli的荧光强度更强，共定位更好，sgRNA的丰度更高，表明dcas13b -sgRNA-适体复合体的快速形成，这表明连接子序列可能是维持适体修饰sgRNA活性的必要条件。有趣的是，基于RT-qPCR检测，与没有dPspCas13b结合的情况相比，在dPspCas13b存在的情况下，sgRNA-In-2 x Broccoli的丰度增加了近30倍。相比之下，sgRNA-3'-F-2 x Broccoli的水平仅增加了约10倍，这表明在sgRNA的环中插入适体可能会导致更好的稳定性。这一结果与之前使用CRISPR-Cas9系统的研究一致，在环中插入适体的效率比在sgRNA支架的3'端更好。4,5对dPspCas13b-sgRNA配合物的结构模拟表明，sgRNA环位于配合物的外侧，说明环区域的工程可能不会影响dCas13b的功能。综上所述，由于sgRNA-in-2x Broccoli性能优越，因此选择其作为后续研究的对象。

接下来，作者使用sgRNA-In-2 xBroccoli标记GCN4重复序列和MUC4 mRNA。在检测了CasFAS系统诱导的荧光后，作者评估了CasFAS对细胞内RNA成像的能力。作者最初引入含有24 x GCN4元素的构建物作为目标，其丰富的重复序列适合在活细胞中进行初步实验，以研究该系统的可行性和敏感性。为了验证靶标的特异性，作者设计了靶向GCN4 mRNA重复区域的sgRNA(GCN4-sgRNA- in -2 x Broccoli)和无靶标间隔gRNA(gNC)。如图2所示，转染后24小时内gRNA信号被降解。毫无疑问，转染24 × GCN4的GCN4-sgRNA-in-2Broccoli细胞的荧光强度比未转染24 × GCN4的细胞更亮。实时qPCR分析进一步显示转染24 × GCN4和GCN4- sgrna - in -2Broccoli细胞的gRNA水平更高。这可能是由于与dCas13蛋白和靶RNA结合后，sgRNAs的丰度提高，稳定性提高所致。与单分子FISH (smFISH)的结果共定位进一步证实了CasFAS系统在GCN4标记中的准确性。

图2.sgRNA-In-2 ×西兰花标记GCN4重复序列

作者受GCN4成像成功的鼓舞，进一步探究使用该方法进行内源性mRNA成像的可行性。MUC4是在许多上皮细胞中大量表达的膜粘蛋白，被认为在其中发挥保护作用。它已成为许多上皮性肿瘤异常表达的候选临床标记物因此，转录本分析对于理解MUC4的表达和功能至关重要。作者使用sgRNA靶向MUC4 mRNA外显子2的重复区域。转染MUC4-sgRNA-In-2 x Broccoli的细胞比转染gNC的细胞荧光强度更强。接下来，作者使用多个小干扰RNA (siRNA)耗尽MUC4转录物，RT-qPCR实验结果证实了这一点，MUC4表达大幅下调。不出所料，作者观察到转染siRNA的细胞荧光强度下降，也验证了靶向的特异性。此外，siRNA敲除MUC4后，细胞内sgRNA水平较低，这与仅转染gNC的细胞相似。同时，smFISH与sgRNA-In-2 x Broccoli共定位数据的统计分析证实，CasFAS能够识别和标记MUC4 mRNA

图3.CasFAS系统中的荧光RNA适配体用于MUC4、lncRNA NEAT1和SATIII RNA标记。

随后，作者在活细胞中对NEAT1做了可视化和SATIII的动态跟踪。近年来，长链非编码rna (IncRNAs)因其在发育和疾病过程中的重要基因调控作用而受到广泛关注。例如，NEAT1是一种IncRNA，可与各种RNA相互作用，如MALAT1，而且在人类肿瘤中经常过表达，被认为是一种潜在的诊断生物标志物和治疗靶点。因此，跟踪NEAT1可以帮助我们可视化与RNA或蛋白质的动态相互作用，从而了解活细胞中的生物机制。接下来的问题是，之前的方法是否可以用于这种具有复杂结构和复杂交互组的IncRNA的成像。通过比较NEAT1-sgRNA-in-2 xBroccoli和smFISH之间的信号重叠，作者确定CasFAS能够标记IncRNA NEAT1。真核细胞暴露于应激条件后，会形成许多RNA-蛋白质组合。热应激诱导表达的长链非编码RNA Satellite II/ (Satll)在热休克转录因子1 (HSF1)依赖转录后聚集形成核应激体(nSBs)，导致热休克诱导HSF1聚集。此外，据报道，在化学胁迫后，如亚砷酸钠(SA)处理，Satll/ RNA也会在nSBs中积累。影像学方法有助于揭示核糖核蛋白(RNP)颗粒的组成和动力学，并有望揭示其功能的解释。为了确定本研究的系统是否适合于观察核应力体中的RNA，作者基于之前的研究结果设计了sgRNA来靶向Satll/IncRNA 。通过SA处理下Satlll-sgRNA-In-2 x Broccoli的1分钟间隔时延成像，作者观察到与未处理条件相比明显的聚集信号。Satll/的这种特异性聚集类似于HSF1mRuby3的红色荧光，表明Satll/和HSF1形成了核应力场体。这些结果表明，CasFAS也可以用于研究IncRNAs和跟踪RNP颗粒的形成。

之后作者检验了CasFAS系统与RNA适体Pepper兼容。CasFAS系统的优点之一是，荧光RNA适配体可以通过方便的替换编码RNA适配体基序的序列，很容易被其他种类的RNA适配体物种所改变。接下来，作者将CasFAS的荧光RNA适配体部分更改为另一种RNA适配体Pepper，其优点是体积更小、荧光更亮、更稳定，发射最大值范围从青色到红色。与sgRNA-Broccoli相似，在没有dPspCas13b的情况下，没有观察到可检测到的荧光信号。使用GFP类荧光团合成染料HBC530，与dPspCas13b结合后出现绿色荧光。得益于适配体和化学荧光团的小尺寸，可以整合多重RNA适配体以获得更高的荧光亮度和信噪比。因此，作者设计了一系列用2×Pepper、4×Pepper和8×Pepper适体修饰的sgRNAs，并通过体外荧光试验研究了它们的性能。随着适体数量的增加，荧光信号逐渐增强。由于荧光强度最强，为8 x Pepper，用于后续的活细胞成像研究。与sgRNA-In-Pepper相比，具有更多适体的sgRNA-In-8 x Pepper产生了明显更强的荧光信号，这与体外荧光检测的结果一致，表明其在研究活细胞中低丰度RNA方面具有潜力。值得一提的是，sgRNA-In-Pepper和sgRNA-In-8xPepper均与dPspCas13b-RFP共定位。与之前Broccoli的研究结果类似，在dPspCas13b存在的情况下，细胞内sgRNA-in-8 x Pepper转录本的丰度远远高于sgRNA-3'-F-8 x Pepper和sgRNA-3'-8 x Pepper的水平，再次证实了在环区插入适应体的sgRNA的稳定性。sgRNA-In-8 x Pepper的显微镜和FACS结果表明，除了Broccoli，CasFAS系统还与其他种类的荧光RNA适体兼容，如Pepper。

图4.CasFAS系统与Pepper RNA适配体

接下来，作者通过更换染料进行切换实现了CasFAS系统的颜色的更替。作者想确定CasFAS系统与活细胞中的Pepper适体的RNA靶向能力。外源性GCN4和内源性MUC4 mRNA已经使用sgRNA-Pepper支架成功标记和成像，并伴有明显的荧光信号。作者通过与smFISH探针共定位分别确认了它们的成像准确性，表明具有良好的RNA成像能力。Pepper最吸引人的优点是构建了从青色到红色的广泛光谱范围的HBC类似物，仅使用一种适体就可以生成荧光调色板。然后，作者想知道CasFAS的荧光颜色是否可以只通过改变荧光染料来切换。例如，用发色团HBC620代替HBC530还原的绿色荧光可以转化为红色荧光。不出所料，sgRNA-Pepper的红色荧光也可以被dPspCas13b-GFP与绿色荧光信号共域。得益于HBC530和HBC620具有相同的适配体序列，作者下一步研究是否可以通过在活细胞中通过清洗和抑制过程只更换荧光试剂来实现简单的荧光开关。令人满意的是，带有sgRNA-In-8 x Pepper的CasFAS系统只需要将培养基中的HBC530改变为HBC620，就可以轻松地将荧光发射从绿色信号转换为红色信号，从而进一步实现了ß-actin成像的颜色变化。一般来说，CasFAS平台能使活细胞中更容易的颜色切换，这是其他基于CRISPR的方法无法实现的。与基于荧光蛋白的CRISPR成像相比，CasFAS在RNA标记和荧光转化方面的灵活性可能在创建稳定细胞系或转基因动物方面具有更出色的潜在应用价值。

再然后，作者用CasFAS系统进行多色RNA标记。CRISPRainbow系统将RNA发夹(MS2、PP7和boxB)连接在sgRNA的3'端，招募发夹结合域融合荧光蛋白，可以同时实现染色体位点的多色标记。接下来作者探究CasFAS系统是否可以通过组合不同种类的荧光RNA适体产生“彩虹”来实现多色RNA成像。作者设计了两种方法来进行多色内源性RNA成像。一种是将两个RNA适体组装到一个sgRNA上，如sgRNA-in-2xBroccoli-2 x Pepper。另一种是同时使用两种修饰的sgRNA，如sgRNA-in-2 xBroccolisgRNA-in-8xPepper。结果表明，这些方法可以将MUC4 mRNA以不同的颜色进行可视化，从而得到了预期的双色RNA成像平台。与之前使用一对RNA发夹和发夹结合域融合荧光蛋白的CRISPRainbow系统相比，荧光适体的体积更小，灵活性更强，使CasFAS系统具有更容易实现多色成像的优势。

图5.同时定位和实时跟踪多个rna

为了同时成像同一细胞中的不同RNA，传统的方法是部署不同的dCas蛋白质类器官，每一种都与特定的荧光蛋白融合或招募。然而，有两个主要问题限制了它的应用。一个值得关注的问题是缺乏足够的具有足够效率的dCas同源物用于核酸标记和成像。最近有研究者筛选了8个dCas13同系物来成像和跟踪RNA，但只有两个是合格的。第二，每个dCas蛋白都应该与其特定的sgRNA配对，导致太多的质粒给转染过程带来负担。然而，在CasFAS系统中，只需要一种dCas蛋白。对于不同的靶标，具有不同引导序列的多重sgRNAs与各种荧光RNA适体配对，可以同时实现额外的RNA成像，而不需要考虑上述两个问题。因此，通过将NEAT1sgRNA-In-2 xBroccoli-2 xPepper、β-actitin-sgRNA- in-8xPepper和MUC4-sgRNA-In-2xBroccoli聚集在HEK 293T细胞中进行了多色RNA标记。可以在单个细胞中观察到三种颜色(NEAT1，橙色;MUC4,绿色;B-actin，红色)，表明这三个系统足够正交，可以区分不同的RNA。此外，CasFAS系统还可以对活细胞中RNA的动态进行正交跟踪。为此，作者使用MUC4-sgRNA-in-2xBroccoli进行MUC4标记，使用satll -sgRNA-in-8xPepper进行satll标记。在未处理的对照组细胞中，MUC4和Satll/的荧光信号都有不同的颜色和位置，而Satlll未见聚集。SA处理后，作者成功地通过聚集satllll跟踪了核体的形成，而对MUC4的荧光信号没有影响。总的来说，具有荧光RNA适配体的sgRNA对不同RNA靶标表现出足够的特异性来识别自己的靶标，显示出同时识别同一细胞内不同RNA的能力。值得强调的是，与以往的研究需要多个dCas蛋白及其独特的sgRNAs不同，CasFAS更直接，只需要一种dCas蛋白，可以实现多色成像和动态跟踪，具有良好的正交性。

紧接着，作者利用CasFAS系统进行了细胞内RNA-RNA相互作用成像。RNA分子之间的相互作用在许多基本的细胞活动中起着至关重要的作用。然而，可视化细胞内RNA-RNA相互作用(RRIs)的技术是缺乏的。在细胞空间中成像RNA-RNA相互作用有助于我们更直接地理解和验证这些相互作用。之前的研究发现IncRNA NEAT1与MALAT1之间存在相互作用，smFISH进一步证实了这一点。因此，作者想知道CasFAS系统是否也可以观察到活细胞中的RNA-RNA相互作用。为此，作者接下来用MALAT1-sgRNA-In-8 xPepper和NEAT1-sgRNA-In-2 xBroccoli同时构建了RNA-RNA相互作用跟踪策略。针对NEAT1的5’区域设计的NEAT1-sgRNA-in-2 xBroccoli呈现明显的绿色荧光，与MALAT1-sgRNA-In-8 xPepper的红色信号明显共域。这一结果与之前的报道一致，MALAT1可以结合NEAT1的5’区域，表明CasFAS具有监测细胞内RNA-RNA相互作用的能力。

最后，作者团队利用CasFAS观察发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)在293T细胞中的表达。发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)是一种新出现的蜱虫传播病毒，可在伴有血小板减少和出血性并发症的人类中引起急性发热性疾病。由于死亡率高，尚无有效的治疗方法或疫苗可用于临床，有必要扩大了解该病毒的工具箱。此前，作者对SFTSV感染的临床样本进行了转录组学和表观遗传学研究。将SFTSV mRNA的分布可视化也具有重要意义，这可能有助于了解该病毒的致病机制。为了生成一个有效且容易靶向SFTSV的系统，作者开发了一个表达多个sgRNA-In-2 x Broccoli的单一载体，并设计了基于金门组装的策略。作为原理证明，作者将三个靶向SFTSV的crRNA克隆到载体中。为了测试该系统，293T细胞在感染后48小时被MOl为1的SFTSV感染，以及未感染的对照细胞。为了确认sftsv感染，对SFTSV-NP mRNA进行了实时PCR分析。这表明，与对照细胞(MOCK)相比，SFTSV感染的293T细胞(SFTSV)中SFTSV-NP mRNA水平较高，表明成功感染。在未感染的和gNC样品中，细胞仅显示微弱且弥散的荧光信号。相比之下，在SFTSV-sgRNA-In-2 x Broccoli感染的细胞中，很大一部分细胞显示出非常强的局域信号。这些数据表明，CasFAS可以同时可视化细胞中的SFTSV RNA。本研究为SFTSV生物学研究提供了一种新技术，可能用于研究活细胞中病毒-宿主的相互作用，用于诊断和药物筛选。

图6.用CasFAS可视化血小板减少综合征病毒(SFTSV) RNA

讨论

多年来，在RNA-seq方面的技术努力已经彻底改变了我们对RNA的理解，RNA伴随着各种显著的生物功能。然而，活细胞中的RNA可视化工具落后于RNA谱分析方法。最近，CRISPR系统因其在细胞内RNA成像和基因组或转录组编辑中的应用而广泛流行。Cas9和Cas13的核酸酶死亡版本可以靶向RNA，并在与荧光蛋白融合的同时有效地点亮感兴趣的RNA，尽管dCas9需要PAM序列。CRISPR-荧光蛋白结合策略已经证明了它们在活细胞中RNA成像和动态跟踪方面的能力，但仍有足够的改进空间。未结合荧光蛋白诱导的显著荧光背景需要多重融合才能达到最佳信噪比。此外，多重RNA成像需要更多的正交CRISPR-Cas正交配体，这可能需要进一步的发现和筛选。除了Cas蛋白，sgRNA组分也被证明是各种官能团修饰的理想对象，除了它们的靶向能力外，还赋予了其他天赋，例如通过附着荧光RNA适体进行成像。先前的研究证实，sgRNA在没有dCas9的情况下是极其不稳定的。可以认为，未结合的荧光适配体标记的sgRNA会迅速降解，从而降低荧光背景。随着荧光RNA适体亮度和光稳定性的提高，作者希望将CRISPR-dCas13b系统的RNA靶向能力耦合起来，生成一个CasFAS系统来成像活细胞中的RNA。作者证明了CasFAS能够高效、准确地标记和跟踪内源性未标记RNA转录本。此外，SFTSV mRNA的成功可视化表明，CasFAS可以进一步提供关于这种病毒的更多信息，甚至帮助更好地了解、诊断和对抗这种病毒

由于荧光染料体积小，CasFAS具有将多个荧光单元组装在一起的优势。例如，为了获得更好的RNA成像结果，传统的方法是融合或招募荧光蛋白等多个荧光组分来增强荧光强度。有人担心，含有数百个氨基酸的大型荧光蛋白可能会产生不可预测的影响。整合多个RNA适体更容易，而不需要两个适体单元之间的连接子序列。理论上，通过优化连接处的茎的长度，可以进一步减小多个组装的RNA适体的整体尺寸。本研究的结果表明，增加适体的数量可以在不影响其共定位能力的情况下改善荧光信号。此外，荧光发光适体数量的不断增加使CasFAS系统在同时进行多色或多RNA成像时具有更大的灵活性。值得强调的是，仅一种dCas13b蛋白就可以与具有不同引导序列和附着荧光适体的各种修饰sgRNAs配对。这一优势减少了缺乏足够的CRISPR-Cas同源物的影响。此外，化学荧光染料可以通过不同电子性质的基团进行修饰，从而改变其荧光发射波长。因此，一种荧光适体，如Pepper，可以结合光谱范围很广的荧光染料，发射从青色到红色的荧光得益于相同的适体可以与不同的底物耦合的特性，通过清洗和抑制过程在活细胞中实现了简单的颜色切换操作，表明CasFAS系统的多功能性，可能进一步提高荧光信号的准确性。CasFAS系统适用于许多RNA成像应用，如RNA在应激颗粒中的聚集，RNA-RNA相互作用和病毒RNA的可视化。即使在动态过程中，如应激颗粒的形成，Broccoli和Pepper之间的完全正交性使它们能够高效地特异性靶向其RNA靶点。CasFAS以其简单、动态范围、灵敏度和灵活性被认为是一种理想的活细胞RNA标记和成像工具。作者期望随着荧光RNA适体的发展，CasFAS RNA可视化技术在了解细胞RNA动力学和功能方面的效用和适用性将进一步增强。

作者：LZH

审核：ZZX

原文链接：https://doi.org/10.1039/d2sc04656c