推荐一篇JACS在线发表的工作，Antibody Clicking as a Strategy to Modify Antibody Functionalities on the Surface of Targeted Cells。本文的通讯作者是东京大学的Toru Komatsu教授和Yasuteru Urano教授。

抗体由于其与抗原高度特异的结合性质，在生命科学和医药领域都有着极其重要的应用。利用抗体对结合目标高度的选择性，科研人员对抗体进行编译、修饰，实现了诸多抗体自身性质以外的功能，如产生细胞毒性、形成分子影像等等。最近有报道利用光致蛋白聚集而产生细胞毒性的特性，实现了抗体在光免疫疗法方面的应用。本文作者则通过化学交联手段促使抗体偶联物在细胞表面发生交联，进而实现促进细胞内吞以及改变抗体性质和功能的目的。

作者设想，利用蛋白可以针对抗原进行特异性结合的性质，将带有交联基团的抗体富集于靶细胞表面，随后当抗体富集达到一定浓度后，交联反应使得抗体间形成聚集，结构及物理性质的改变将引起这些抗体的理化性质发生变化，从而实现行为和功能的改变(如图1)。

图1. 结合于靶细胞表面的抗体进行交联示意图

Click反应是化学生物学领域常用到的对蛋白及活性分子进行功能化修饰的生物正交反应，本文中作者选用反应条件温和、无需铜催化剂的四氮嗪和环辛炔之间的偶联作为将抗体之间进行连接的工具。作者基于此设计，合成了诸多含四氮嗪或环辛炔的活化酯以对抗体进行修饰，并预期抗体之间可以通过click反应形成交联结构(图2a)。

图2. a) 偶联基团结构；b) 与BCN反应时Tz或MTz的浓度随时间变化；c) b中涉及反应的二级反应速率常数；d) 以MTzS和TAMRA修饰的曲妥珠单抗与修饰了BCNL的曲妥珠单抗反应效果随时间变化；e) 修饰抗体间反应的二级反应速率常数；f) Her2阳性/阴性抗体结合及交联效果对照(抗体修饰TAMRA)；g) 交联后的抗体形成分子量巨大的聚集体

接下来，作者对不同基团间的偶联速率及反应效果进行了表征，实验结果显示，MTzl与BCNL之间的偶联是最高效也是最彻底的。随后，作者通过将活化酯与曲妥珠单抗进行孵育修饰，使得偶联基团修饰于抗体之上，接下来的细胞表面交联聚集结果显示，连接子更长的MTzL与DCNL之间的偶联发生效率更高，而被相对短的连接子偶联物修饰的抗体则少有发生交联。作者认为，在偶联基团相同的情况下，MTzl与BCNL分别具有相对更长的连接子，当抗体结合于细胞表面位置相对固定时，连接子更长的末端偶联基团更有机会与相应的基团发生click反应，从而提高了反应发生的概率。与此同时，作者发现，当结合在细胞表面的抗体发生交联后，所形成的聚集体更容易被细胞内吞。为了验证这一结果，作者通过对照实验发现，将交联好的抗体聚集体对细胞进行孵育时，细胞的摄取状况明显不如先与细胞结合随后交联形成聚集体的方式(图2a)。这一结果也进一步说明了先对抗体进行可交联修饰，使其与细胞结合后再发生交联的顺序对于抗体功能强化的重要意义。此外，作者也发现在不同抗体间形成的交联聚集体的内吞效果更强(图2b)。

图3. a) 标记了TzS或BCNL的Tra单独及共同(形成交联)作用于细胞的摄取状况：作用1 h(左)及3 h(右)；b) Tra-TzS与Per-BCNL单独及共同(形成交联)作用于细胞的摄取状况，相对于a)更多；c) Per与Tra的结构；d) 荧光修饰的抗体展示的细胞内吞效果。

进一步，作者将实验的细胞系扩展到其他两种HER2过表达的细胞系——NCI-N87及SKBR3，并同时验证了帕尼单抗对于EGFR过表达细胞系——A431的结合及交联效果。以上成功交联的实验结果表明，该策略能够广泛适用于多种抗体及相应抗原过表达的细胞之间，形成抗体交联聚集体并进一步发挥功能。

除了有利于细胞内吞，作者还发现在交联的过程中，细胞的形状被很好地刻画出来。利用荧光标记的抗体在细胞表面聚集随后发生交联，我们可以明显的看到区域内每个细胞的轮廓。并且在相当长的时间内(24 h)，这一聚集体并没有对细胞的活性产生威胁，细胞能够完好的保持结构特征。这一结果体现了抗体交联体策略可以有效应用于活细胞成像技术。

此外，作者还发现随着抗体交联体在细胞表面的生成，细胞内的信号通路发生变化，导致细胞功能也受到影响。因此，作者认为抗体交联的策略将有助于通过对细胞信号通路的调节，从而在细胞内源角度对细胞的活性及功能进行控制，最后实现例如控制癌细胞增殖或促进正常组织细胞生长等临床功能。

综上所述，本文作者利用偶联基团修饰的抗体在与细胞特异性结合后发生高效的交联反应，从而形成抗体聚集体。实验结果发现，聚集体的形成不仅有利于抗体偶联物的内吞，也可应用于活体细胞成像，更有助于通过调节细胞信号通路从而达到控制细胞功能及活动特征的目的。由于抗体及抗体偶联物在生物医用领域的广泛应用，此策略将有助于提高抗体偶联物的药物摄取效率、增强抗体类药物在成像等方面的应用，并且有望在细胞信号通路调节方面大放异彩，是在抗体偶联物领域具有潜质的修饰策略。

作者：WYY 审校：WH

DOI: 10.1021/jacs.0c05331

Link: https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.0c05331