分享一篇发表在JACS上的文章，题为：Cell Surface Labeling and Detection of Protein Tyrosine Kinase 7 via Covalent Aptamers。本文的通讯作者是来自匹兹堡大学的Alexander Deiters。

    适配体是一种亲和力和特异性与抗体相当的单链寡核苷酸。目前，共价适配体已成为新型生化工具，可将标签快速、选择性地转移至靶蛋白。例如sgc8c是一种由41 个核苷酸组成的DNA分子，可选择性结合特定的白血病细胞。sgc8c的靶标是蛋白酪氨酸激酶7（PTK7），这是一种无催化活性的跨膜受体蛋白，与细胞生长和迁移相关。PTK7高表达是包括结肠癌、非小细胞肺癌、胃癌和宫颈癌在内的多种癌症的生物标志。因此，PTK7也成为了CAR-T 细胞疗法和抗体药物偶联物临床开发的一个十分具有吸引力的靶点。

    目前，靶向PTK7 的适配体sgc8c已被开发为分子探针，用于癌细胞检测和药物递送。但它同时也存在一定的局限性，例如对核酸酶介导的降解较为敏感，在血清中的半衰期短，以及与靶蛋白的结合时间短等。

    本文作者通过邻近驱动的标签转移来修饰细胞表面的PTK7，利用适配体介导生物素标签转移到蛋白质胞外上的特定赖氨酸残基。由此能够跟踪PTK7的表达、定位和细胞内化（图1A）。作者在sgc8c序列内特定的胸苷处（反应性较高的位点分别是8，27和30）特异性结合炔烃修饰的亚磷酰胺2，生成了亲电适配体，然后来利用叠氮与炔烃的点击反应连接上生物素标签1（图1B），得到最终的共价适配体。

图1. 共价适配体结构与作用示意图。

    将修饰的sgc8c-1适配体与重组PTK7共孵育，使用链霉亲和素-辣根过氧化物酶（SA-HRP）融合蛋白，通过简化的免疫印迹分析生物素转移的效率（图2A）。结果表明，亲电试剂修饰在位置8、27和30的时候，显示出了最高的PTK7标记效率。后续实验中，作者选用了修饰在适配体的环结构域，与PTK7相互作用潜力更大的sgc8c(27)-1。接着，作者将把不同浓度的sgc8c(27)-1与重组PTK7（100nM）共孵育1小时，发现低至62 nM的浓度下即可观察到PTK7生物素化，在500 nM时达到稳定水平（图2B），而将PTK7换位牛血清白蛋白（BSA）后，需在500 nM以上才观察到明显的脱靶标记（图2C&D）。除此以外，sgc8c(27)-1的降解半衰期t_1/2约为63分钟，而它的标记t_1/2为86分钟（图2e）。酶降解与标记过程具有相似的动力学，说明这种快速有效的标记转移方法，有望克服目前适配体对核酸酶不稳定的限制。

图2. sgc8c-1标记PTK7的浓度与动力学。

    接下来，作者对sgc8c(27)-1生物素化的PTK7胞外结构域进行了质谱测序，结果表明有两种明确的肽段内含有生物素化的赖氨酸K501和K636。这些赖氨酸残基位于相邻的非同源Ig结构域（Ig6和Ig7）上。虽然全长PTK7的结构尚未报道，但这两处残基的生物素化表明它们的适配体结合状态非常接近。由此说明sgc8c适配体的环，很可能是结合在PTK7的第六和第七个Ig结构域处或附近。

图3. PTK7模拟模型

    最后，为了实现PTK7 定位的可视化，作者构建了转染PTK7-青色荧光蛋白 (CFP) 融合表达体的NIH3T3细胞，通过与sgc8c（27）-1共孵育，测试了共价适配体的在内化过程中标记、检测和跟踪PTK7的能力。结果表明，在适配体介导细胞表面生物素化后，将细胞与四甲基罗丹明（TMR）标记的中性亲和素（NA）短暂孵育5分钟，即可在细胞膜上观察到TMR荧光。然而，在2小时孵育后，由于细胞表面受体的回收，作者检测到了内涵体中内化的TMR荧光（图4A）。除此以外，作者还选用了PTK7高表达的HepG2、Jurkat细胞，和PTK7低表达的HEK293T细胞，与sgc8c（27）-1共孵育，再染色后通过流式进行转染标签的半定量，发现PTK7高表达细胞的流式信号是低表达细胞的十倍以上。这些结果表明这种共价适配体可用于检测和修饰癌细胞表面高表达的内源性PTK7。

图4. sgc8c-1与活细胞共孵育成像。

    综上所述，作者开发了一种共价适配体，能够通过邻近驱动的标签转移来修饰细胞表面的PTK7，起到标记、检测和跟踪PTK7的作用。为共价适配体应用于癌症诊断和治疗领域奠定了基础。

作者：HYH  审校：LXY

DOI: 10.1021/jacs.3c02752

Link: https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.3c02752