分享一篇近期发表在Biomacromolecules上的文章，题目为Microwave-Induced Transient Heating Accelerates Protein PEGylation。文章的通讯作者是加拿大国立科学研究所的Marc A Gauthier。

    微波辐射辅助化学反应可以缩短反应时间，提高产率并提高特定反应的选择性，近年来越来越多的有机化学实验室配备了微波反应器。然而因为大多数蛋白质在高温下会变性，微波辅助的生物大分子反应仍未被充分探索，在现有的例子中往往使用热稳定性极好的大分子或采用特殊的温度控制手段来避免大分子的变性或降解。本文作者开发了一种利用微波辐射产生的瞬态加热提高蛋白质与聚乙二醇偶联效率的方法，通过良好的散热设备能使蛋白质保持生理活性且适用于多种不同的蛋白质和linker，具有普适性（图1）。另外，作者还尝试探索了该微波诱导方法用于连续流制备的可能性。

图1. 微波辅助的蛋白质聚乙二醇化示意图

    作者制作了一种能够在瞬态加热的同时冷却反应体系的反应器，其构造如图2 。其中微波透过性的全氟聚醚冷却液（紫色）需要提前用液氮预冷，冷却液包裹着反应体系并不断循环；反应体系为水相，水吸收微波的能量，在体系中产生瞬态的高温点，并被冷却剂有效熄灭；体系的温度由一根光纤探头实时反馈，以便实验人员能够及时改变微波功率和冷却剂流速。

图2. 瞬态加热同时冷却的微波反应器

    作者以鸡蛋清溶菌酶HEWL、门冬酰胺酶ASNase、绿色荧光蛋白GFP以及人血清白蛋白HSA为反应模型蛋白，首先研究了微波诱导的瞬态加热对蛋白质及聚乙二醇的影响。如图3所示，作者将HEWL（图3a）与ASNase（图3b）暴露在0-120 W微波功率下20 min，保持体系温度在20 ℃左右。酶活测试、荧光光谱与圆二色光谱显示，处理前后蛋白质的结构没有显著差异。120 W是该反应器能够恒温的微波功率上限。

图3. HEWL与ASNase暴露于微波下没有显著结构变化

    作者使用不同微波功率，探究了微波对于ASNase与醛基聚乙二醇使用还原胺化法偶联效率的影响（图4）。微波功率越高，ASNase的聚乙二醇化程度越高；在没有微波的情况下，反应20 min后平均每个ASNase接枝16±9条聚乙二醇链，而使用100 W微波处理20 min后ASNase上所有氨基均可聚乙二醇化，接枝87±7条聚乙二醇链。此外，微波诱导对使用马来酰亚胺-巯基反应的偶联也有类似的促进作用。

图4. ASNase与聚乙二醇使用还原胺化法微波诱导偶联

    接下来，作者使用HEWL与GFP为模型研究了微波诱导偶联反应的动力学（图5），HEWL有7个氨基反应位点，GFP有21个氨基反应位点。作者使用5 kDa与20 kDa两种不同分子量的醛基聚乙二醇以5:1与50:1两种投料比分别与两种模型蛋白反应，并监测了反应进程。理论上，使用50:1聚乙二醇时反应应遵循（伪）一级动力学，然而在没有使用微波诱导时聚乙二醇化步骤不符合一级速率方程，反而更符合二级速率方程，这表明聚乙二醇的醛基官能团并未完全暴露；而在微波诱导的反应条件下，测得该反应是一级反应，表明微波对官能团的可及性有积极的影响。

图5. 聚乙二醇化反应动力学实验

    为了进一步拓展微波反应器的应用范围，作者将连续流与该反应器结合，避免了实验放大过程中的热交换问题，实现了聚乙二醇化偶联物的大量制备（图6）。

图6. 连续流下的微波诱导聚乙二醇化

    综上所述，本研究使用微波诱导的瞬态加热促进了蛋白质与聚乙二醇的偶联反应，成功地提高了多种偶联方法下的聚乙二醇接枝率，并将该方法与连续流结合，实现了微波诱导的聚乙二醇-蛋白质偶联物大量制备。

作者：SYM  审校：HYH

DOI: 10.1021/acs.biomac.3c00250

Link: https://doi.org/10.1021/acs.biomac.3c00250