分享一篇近期发表在Bioconjugate Chemistry上的文章，题为Glycosylation Improves the Proteolytic Stability of Exenatide。文章的通讯作者是来自墨尔本大学的Mohammed Akhter Hossain教授及John D. Wade教授。

    2型糖尿病是现代极为常见的代谢性疾病，胰高血糖素样肽-1（GLP-1）能够调节葡萄糖依赖的胰岛素分泌，具有良好的血糖调节功能，然而其体内半衰期短（t_1/2<2 min）。艾塞那肽与GLP-1有53%的氨基酸序列同源性，是FDA批准的第一个GLP-1受体激动剂（t_1/2 =2.4 h）。然而，艾塞那肽仍需要每天注射两次，因此对其长效类似物的需求依然存在。同时，由于艾塞那肽易发生Asn28脱酰胺化，增强其稳定性也十分必要。

    糖基化是一种常见的蛋白质修饰，通常能够改善溶解性，增加稳定性。在本文中，如图1所示，作者尝试在Asn28位置引入双触角唾液酸寡糖，并探究糖基化艾塞那肽的各类性质。

图1. 糖基化艾塞那肽结构设计

    由于Asn28处带有位阻较大的寡糖修饰，因此很难通过固相合成方法完成全链的制备。因此作者选择了酶介导的化学连接，其中，Omniligase-1是一种广泛使用的连接酶，能够催化无保护的C端硫酯与N端游离胺间形成酰胺键。为得到全长糖基化肽，如图2a所示，作者首先合成了艾塞那肽（1-21）-HMBA-K，以及糖基化的艾塞那肽（22-39）。其中，双触角唾液酸寡糖被修饰到Fmoc-Asn上，并通过固相合成直接引入至多肽中。随后，在缓冲液中，加入连接酶，通过HPLC监测连接反应的进行。在纯化后得到了目标产物，收率为37%。

图2. 糖基化艾塞那肽合成路线

    如图3左所示，圆二色光谱的结果显示，糖基化艾塞那肽的α螺旋度更高，可能是糖基化修饰增加了多肽溶解性，或糖与多肽序列的一些氢键相互作用等稳定了结构。另外，细胞中的cAMP积累反映出糖基化修饰并未影响激动剂介导的GLP-1R信号转导。

图3. 糖基化艾塞那肽体外性质

    作者还进行了OGTT口服葡萄糖耐量实验。注射后1小时，糖基化艾塞那肽血糖降低至与艾塞那肽相同的水平，另外，在口服葡萄糖后，给药糖基化艾塞那肽组的血糖水平变化更加明显，曲线下面积图中进一步支持这一结论。

图4. 口服葡萄糖耐量实验

    另外，作者将艾塞那肽在大鼠血清中体外37℃孵育，检测其抗水解酶的稳定性，如图5所示，糖基化修饰后，体外半衰期几乎提高1倍，由24小时提高到46小时。螺旋度增加以及寡糖的空间阻碍也许是限制蛋白酶降解的原因。

图5. 体外血清稳定性

    综上所示，作者使用酶连接法合成了糖基化修饰的艾塞那肽，并增加了其螺旋度与体外血清稳定性。体内实验中，糖基化修饰的艾塞那肽也被证明具有更佳的降糖能力。

作者：ZRC

DOI: 10.1021/acs.bioconjchem.3c00120

Link: https://doi.org/10.1021/acs.bioconjchem.3c00120