分享一篇近期发表在Biomacromolecules上的研究进展，题为Secondary Structure-Governed Phase Separation Behavior in Glutamate-Based Polypeptides。这篇文章的通讯作者是宁波大学材料科学与化学工程学院的陈重一教授。

    相分离行为对于蛋白质等生物大分子的功能具有重要意义。其中，最低临界共溶温度(LCST)和最高临界共溶温度(UCST)分别对应温敏性聚合物的两种相分离行为，特别是UCST被认为是聚合物链内和链间的非共价相互作用引起。而蛋白质中的肽链也可以通过链内和链间的非共价相互作用驱动折叠形成α-螺旋或β-折叠等二级结构，因此研究相分离行为与二级结构之间的关系很有可能有利于理解多肽和蛋白质的相分离行为。

    为在分子水平上调控相分离行为，作者在聚谷氨酸侧链上引入不同的对称基团来改变局部化学环境，包括乙醇胺(MEA)、二乙醇胺(DEA)以及二异丙醇胺(DSPA)。如图1所示，作者从γ-苄基-_L-谷氨酸(BLG)出发，先制得其N-羧基内酸酐(NCA)单体，然后依次通过NCA开环聚合、苄基脱保护以及羧基缩合三步反应得到了羧基官能化的聚谷氨酸。

图1. 聚谷氨酸衍生物的合成

    随后，作者发现这些具有不同侧链修饰基团的聚谷氨酸均具有UCST行为(图2a)，并且具有不同程度的可逆滞后性溶解行为，其中DEA修饰程度为25%的聚谷氨酸(DEA_25%)具有最高的滞后程度(图2b, c)。作者还通过圆二色光谱(CD)研究了不同pH下聚多肽的二级结构，结果表明当pH为1-5时，MEA_25%、DEA_25%和DSPA_24%均表现出典型的α-螺旋结构(图3a, c, e)，但是仅在pH≤4时表现出UCST行为(图3b, d, f)，可能原因是pH=5时去质子化的羧基之间静电排斥力较强，抑制了多肽的聚集过程。

图2. UCST行为表征

图3. CD光谱与透射率曲线

    为进一步探究二级结构与相分离行为之间的联系，作者还表征了不同接枝比聚谷氨酸衍生物的二级结构。如图4所示，结果表明，其螺旋程度随着接枝比增加而降低，可能原因是侧链修饰基团的无序插入扰乱原本规则的螺旋结构。由于DSPA的疏水性最强，其修饰的聚谷氨酸链间相互作用最强，因此形成α-螺旋的倾向性最低；而DEA的羟基比MEA多，因此亲水性更强，形成α-螺旋的倾向性最高。此外，如图5所示，不同修饰度下聚谷氨酸的透射率曲线表明MEA和DEA修饰的聚多肽的浊点温度(T_cp)随修饰度增加而降低，这可以归因于螺旋含量的降低；但是DSPA修饰时T_cp随修饰度无明显变化，可能原因是疏水性更强的DSPA侧基补偿了链间的非共价相互作用。

图4. 不同修饰度下聚谷氨酸的CD光谱

图5. 不同修饰度下聚谷氨酸的透射率曲线

    由于滞后性也是相分离行为的一个关键因素，作者还研究了三种不同侧链修饰聚谷氨酸的温度响应性行为。如图6所示，结果表明三种聚谷氨酸的螺旋含量均在加热后降低，并在冷却后能够恢复至初始值。同时，螺旋含量在经过6个“加热-冷却”循环过程后不会发生明显变化。

图6. pH=1时三种聚谷氨酸CD光谱随温度的变化

    最后，作者将聚谷氨酸CD光谱中的[θ]_{222 nm}和透射率曲线进行叠加，从而进一步探究二级结构与迟滞现象的关系。令人惊讶的是，滞后性与二级结构恢复的温度区间基本一致(图7)。

图7. [θ]_{222 nm}强度与透射率叠加示意图

    总的来说，作者通过NCA开环聚合以及后修饰得到了三种侧链基团不同的聚谷氨酸。这些聚谷氨酸具有UCST，并且其T_cp与二级结构具有相关性，表现为不同螺旋含量及其恢复速率与其温度滞后区间相对应。这些研究有利于加深对多肽的二级结构与相分离行为之间的关系理解，并且提供了一种二级结构调控的功能化肽基材料的设计途径。

作者：QJC  审校：WLT

DOI: 10.1021/acs.biomac.3c00322

Link: https://doi.org/10.1021/acs.biomac.3c00322