分享一篇近期发表在Biomacromolecules上的文章，题为Exploring Receptor Binding Affinities and Hepatic Cell Association of N‐Acetyl‐_D‐Galactosamine-Modified β‐Cyclodextrin-Based Polyrotaxanes for Liver-Targeted Therapies。文章的通讯作者是来自东京医科齿科大学的Atsushi Tamura教授。

    在多种代谢性疾病如动脉粥样硬化、阿尔兹海默症的进程中，都存在游离胆固醇在细胞内的积累。而β-环糊精结构中的疏水腔能够包络游离的胆固醇，因此近年来其治疗应用备受关注。但β-环糊精在血液中循环半衰期短，施加高剂量则又会带来较强的肾脏毒性。由此，在本文作者的前期工作中，开发了由多个β-环糊精沿线性聚合物轴穿插形成的超分子体系PRX，如图1所示。同时，聚合物轴末端使用了酸响应基团，在细胞的酸性内体中能够选择性释放β-环糊精。

图1. GalNAc-PRX的肝靶向性示意图

    肝脏作为重要的胆固醇代谢器官，进一步改善肝细胞中的吸收特异性及效率具有重要的意义。由于肝细胞表面高水平、特异性地表达ASGR受体，其特异性配体N-乙酰半乳糖胺GalNAc已被应用于肝靶向递送。由此，作者尝试制备GalNAc-PRX，探究其治疗效果。

    首先，作者以β-环糊精作为环状分子，PEG-b-PPG-b-PEG作为聚合物轴，N-三苯甲基作为酸响应末端基团制备了PRX。随后如图2所示，向β-环糊精的羟基引入叠氮基团，再通过铜催化的环加成反应将炔基修饰的GalNAc连接到PRX上。通过核磁和红外等结果确认成功合成了GalNAc-PRX。

图2. GalNAc-PRX合成路线

    接下来，作者使用固定有ASGR受体的传感芯片进行SPR实验，评估结合亲和力。由图3A-C可见，GalNAc-PRX均与ASGR显示出浓度依赖的结合强度，而且随修饰GalNAc数目的增加（36，59，77）而增加。除此之外，修饰有同样数目的甘露糖（Man）PRX亲和力明显低于GalNAc-PRX。以上的结果都表明GalNAc能够特异地识别ASGR，且修饰的数量有利于增强结合。

    进一步拟合得到的动力学参数表明，解离速率常数k_d随PRX上修饰的GalNAc数目增加而降低，解离平衡常数KD也更低。这可能是由于GalNAc-PRX中的线性β-环糊精能够沿聚合物轴自由移动，避免了常见多价相互作用中的空间不匹配，从而结合更强。

图3. GalNAc-PRX与ASGR亲和结合力分析

    随后，利用表达高水平ASGR的HepG2细胞进行共聚焦成像以及流式分析，定量细胞的摄取效率。有趣的是，如图4所示，细胞荧光强度似乎随修饰的GalNAc数目的减少而增加，36GalNAc-PRX是其中荧光强度最强的。这与ASGR亲和结合强度的趋势并不一致。

图4. GalNAc-PRX的HepG2细胞摄取情况

    事实上，ASGR识别GalNAc配体后，含有GalNAc的复合物被内化到细胞中，运送到早期内体。前期研究表明，ASGR在与配体结合的几分钟后会通过循环内体运回到膜上。由此作者猜测，由于77GalNAc-PRX与ASGR的亲和力强，导致其无法从ASGR上解离下来，继而被循环内体从细胞中清除。为验证这一猜想，作者在细胞中瞬时表达了荧光标记的早期内体与循环内体标记物（Rab5及Rab11），进行共定位与定量分析。如图5所示，77GalNAc-PRX与循环内体高度共定位，这表明77GalNAc-PRX在进入细胞后倾向于被运输到循环内体中，因此细胞摄取率低。

图5. 循环内体与GalNAc-PRX共定位分析

    最后，作者使用GalNAc-PRX测试了降低胆固醇的效果。使用胆固醇转运体抑制剂处理，诱导HepG2细胞中积累胆固醇。GalNAc-PRX处理后，使用filipinII染色游离胆固醇，进行共聚焦成像。由图6可见，36GalNAc-PRX处理具有最低的荧光强度，这表明具有少量修饰的GalNAc-PRX是非常有潜力的治疗分子。

图6. 在胆固醇积累细胞模型中的治疗效果评价

    总结来看，为提高基于β-环糊精超分子体系（PRX）的肝脏特异性及摄取效率，作者制备了GalNAc修饰的PRX，并探究了其与ASGR受体的亲和力及细胞摄取情况。实验的结果表明具有少量GalNAc修饰的PRX体现出优越的降低胆固醇效果，具有开发治疗应用的潜力。

作者：ZRC  审校：ZHS

DOI: 10.1021/acs.biomac.3c00194

Link: https://doi.org/10.1021/acs.biomac.3c00194