分享一篇近期发表在JACS上的文章，题为Modular Diazo Compound for the Bioreversible Late-Stage Modification of Proteins。文章的通讯作者是来自麻省理工学院的Ronald T. Raines教授。

    在蛋白质递送等领域中，理想的蛋白质修饰应该是“无痕的”，不可逆的修饰通常会损害蛋白质的功能，并且在涉及活细胞的应用中可能存在问题。通常，半胱氨酸和赖氨酸残基是主要的修饰位点，但半胱氨酸在蛋白中的丰度较低(2.4%）。赖氨酸尽管丰度更高，溶剂可及性强，但可逆修饰赖氨酸的策略很少。

    谷氨酸（6.4%）和天冬氨酸（4.5%）较高的丰度以及溶剂可及性使得羧基成为了偶联修饰的可能位点。本文中作者开发了一种具有化学选择性、模块化、生物可逆的羧基修饰策略，并尝试利用这一策略将蛋白质无痕递送到哺乳动物细胞内。这种通用策略是基于如图1A所示的一种三组分化合物，它包含蛋白质偶联结构域（重氮）、后修饰位点（双硫吡啶）、以及无痕释放位点（碳酸酯）。

图1. 重氮化合物设计示意图

    首先，作者通过三步的合成路线制备得到化合物1，随后，以两种代表性的蛋白进行标记尝试，Cyt c（无半胱氨酸），GFP（两个活性半胱氨酸），并使用细胞穿透肽环十精氨酸HS-cR10作为巯基配体，通过质谱分析确定标记程度。

    如图2所示，对于Cyt c，在pH 5.5条件下加入100当量的化合物1，最多5个位点被修饰，加入巯基配体孵育后，最多2个位点被修饰（Cyt c-1-cR10）。对于GFP，由于存在能够与双硫吡啶反应的活性巯基，因此在与蛋白偶联前，预先将化合物1与巯基配体混合，再加入到蛋白中。GFP同样成功获得最多两个位点的修饰。以上的结果表明，通过模块化合物能够成功向不同类型的蛋白安装双硫键连接的功能化修饰。

图2. 针对不同模型蛋白的修饰策略

    接下来，作者继续探究修饰的可逆性。作者设想，酯酶对碳酸酯的裂解将生成亚甲基醌的结构（图3A  QM-1）。因此，作者合成了小分子模型MGA-1，与猪肝酯酶共孵育24小时。生成的QM-1表明酯酶能够以无痕的方式释放模型酸。

    类似的，作者用猪肝酯酶处理Cyt c-1-cR10，也成功地去除了蛋白质上的修饰（图3C）。以上结果表明利用碳酸酯部分进行无痕释放的能力。

图3. 酯酶催化的无痕释放

    随后，作者将这一无痕释放策略应用于蛋白的胞质递送。上文中制备的蛋白-细胞穿透肽偶联物（Cyt c-1-cR10）被添加到Hela细胞中。在活细胞荧光成像的结果中（图4B），cR10修饰的偶联物在2.5小时内大量进入细胞。

另外，通过Cyt c的细胞毒性实验，作者充分验证了细胞内酯酶作用下的蛋白无痕释放。原理上，Cyt c激活细胞中的蛋白级联水解，进而诱导细胞凋亡。如图4C所示，除Cyt c-1-cR10外，作者还制备了以赖氨酸不可逆修饰的偶联物Cyt c-BCN-cR10，尽管两种cR10偶联物都具有较高的胞质摄取，但Cyt c-BCN-cR10在诱导细胞凋亡的能力上明显下降。质谱分析表明Lys86被修饰，而它存在于Cyt c诱导凋亡时，形成复合物的作用界面上。那这一结果也充分表明了生物可逆修饰策略的优势。

图4. 蛋白的细胞递送 A. 机制 B. 荧光图像 C. Cyt c偶联物细胞毒性

    总结来看，作者开发了一种通用的蛋白质偶联策略，能够可逆无痕修饰蛋白质表面的羧基，为蛋白的胞质递送提供了便利使用的平台。

作者：ZRC  审校：HYH

DOI: 10.1021/jacs.2c11325

Link: https://doi.org/10.1021/jacs.2c11325