给大家分享一篇近期发表在Organic Letters上的文章，题为：C‑Terminal Arginine-Selective Cleavage of Peptides as a Method for Mimicking Carboxypeptidase B。该工作的通讯作者是来自美国佐治亚州埃默里大学的Monika Raj教授。

    利用蛋白酶裂解酰胺骨架有助于分析蛋白质的化学序列以及确定其对生物活性的影响，而近年来通过化学方法剪切蛋白质的技术不断发展，已能实现N端任意氨基酸残基的剪切。肽和蛋白质中C端酰胺键的特异性剪切作为一种重要转化，在蛋白质组学、位点特异性官能化等方面有着重要应用，然而实现C端特定残基选择性裂解的化学方法仍较为缺乏。在此，作者首次实现了在温和水溶液中选择性剪切C端精氨酸残基。

    作者设想通过9,10-菲醌与精氨酸的胍基偶联，从而实现对肽键的选择性切割 (图1)。首先，胍基对9,10-菲醌亲核进攻得到中间体A，在碱性条件下进一步裂解为中间体B(L-谷氨酸-γ-半醛)和一分子荧光副产物。作者假设主链酰胺随后与B侧链醛基缩合形成类似吡咯啉的中间体C，活化的酰胺键在碱性条件下水解得到羧酸2。

    作者首先选用模型底物dansyl-HFANR-CONH₂ (1a)与9,10-菲醌在37℃的H₂O/ACN中反应3h，未观察到产物形成。接着，作者向反应体系中加入温和碱，如DMAP和Et₃N，同样不发生反应。作者进一步改用强碱DBU，观察到了C端精氨酸残基酰胺键的裂解，但DBU与底物1a共洗脱导致HPLC难以分析。

图1. C端精氨酸裂解的猜想路径和条件优化

    接下来，作者使用无机碱NaOH在2、1、0.5 M不同浓度下实验，虽然观察到C端Arg酰胺键的断裂，但也观察到Asn侧链酰胺水解变为Asp。于是，作者对NaOH浓度进行筛选，观察到在浓度为0.08 M时，能实现C端Arg的裂解且其他侧链不受影响。而当浓度进一步降低至0.02 M时，可以观察到L-谷氨酸-γ-醛基中间体B的形成。通过上述研究，作者得出C端精氨酸裂解的最佳反应条件为：在37 ℃下，0.08 M NaOH的溶液(H₂O/ACN = 10：1)中，与3当量的9,10-菲醌反应3h。

    为了确定上述方法对精氨酸残基的化学选择性，作者对含有其他活性氨基酸的肽进行了测试，未观察到任何其他氨基酸的修饰。当多肽除C端外含有Arg时，虽没观察到多肽主链的断裂，但可以观察到L-谷氨酸-γ-半醛的形成。此外，C端精氨酸邻近的氨基酸不会影响切割效率，且在高浓度9,10-菲醌当量下可以观察到两个Arg残基的连续裂解，证实了上述方法的高化学选择性和位点特异性。

图2. 最佳条件下对不同肽段C端精氨酸进行裂解的转化率

    接着，作者通过密度泛函理论(DFT)计算来研究反应机理(图3)。对C端和链中含有Arg的中间体H₃N⁺-GR(CHO)G-CO₂⁻和H₃N⁺-GGR(CHO)-CO₂⁻及其相应的类吡咯啉中间体的计算研究表明，C端Arg裂解所需能量比链内显著降低(~ 16 kcal/mol) 。于是作者提出假设，Arg在C端形成的五元类吡咯中间体(中间体C)的空间位阻较低，类吡咯啉结构的形成破坏了酰胺键的共振结构从而活化了羰基，易受到亲核进攻而发生裂解。

    为了证明上述猜想，作者开展了机理实验，选择dansyl-HR-CONH₂作为模型二肽，加入NaOMe作为碱和亲核试剂，与9,10-菲醌在37℃无水甲醇中反应3小时，裂解产物中甲酯的形成支持了亲核试剂进攻活化酰胺的假设。

图3. DFT计算和机理实验

    综上所述，本文报道了一种通过9,10-菲醌裂解C端精氨酸的化学方法，并基于DFT计算和机理实验解释了反应的位点特异性，为合成不同官能团(如酯、硫酯和酰胺)的C端肽提供了新的方案。

作者：LMY  审校：WLT

DOI: 10.1021/acs.orglett.3c02418

Link: https://doi.org/10.1021/acs.orglett.3c02418