细胞RNA的选择性标记和可视化为研究细胞内的动态过程提供了有力手段。多年来，人们已经研究出基于寡核苷酸的杂交探针、基于蛋白质的荧光报告基因、荧光适配体的RNA标记以及RNA的化学酶修饰等多种方法。这些发展使得能够更精确地研究RNA定位和动力学。但是这些方法通常价格昂贵，方案复杂（需要显微注射、质粒转染或Cu（I）催化的叠氮化物-炔烃环加成），因此应用相对受限。

与此相比，小分子荧光染料有较为显著的优势：低分子量染料易于使用、有良好的细胞通透性、有优异的化学可处理性并显示出可调的光谱和光物理特性。但是用于RNA成像的细胞渗透性小分子染料严重缺乏，迄今为止，SYTO RNASelect（SYTO）是唯一与活细胞成像兼容的市售RNA染料，但仍存在许多不足。

苯乙烯染料是有用的成像探针和荧光传感器，因为它们对环境变化或结合大分子具有很强的荧光响应。两个研究小组先前致力于开发两种基于吲哚的“push–pull”苯乙烯荧光团（MPI和IN），但在实际应用中受到其适度荧光增强和量子产率的限制，以及与这些绿色发光染料相关的相对较高的背景。

在本文中，作者通过产生吲哚环的区域异构体和等位素类似物来研究电子供体的位置和电子效应，得到新的苯乙烯类似物，是市售RNA染料SYTO RNASelect的绝佳替代品。

首先，作者设计与合成了染料1a-1d。

在新染料的设计合成中，MPI和IN被用作母体化合物。策略一保留吲哚供体并改变吲哚环上的取代位置，策略二用indolizine（另一种富含电子的芳烃）替换吲哚。化合物1a–1d的合成如图二所示。吲哚通过钯催化的2-吡啶丙醇分子内环化合成，随后根据先前报道中的步骤使用Vilsmeier-Haack反应转化为formyl-indolizines（2c和2d）。最后，the formyl-indoles（2a和2b）和formyl-indolizines（2c和2d）与N-甲基-4-甲基吡啶进行Knoevenagel缩合反应，产生苯乙烯探针1a-1d。

图2. 苯乙烯染料1a–1d的合成

合成苯乙烯染料后，对其光物理性质进行了评价。1a–1d的吸光度和发射光谱如图3所示。在T.E.缓冲液中，1a和1b分别在422和410 nm处表现出最大的吸光度波长，表现出162和142 nm的大斯托克斯位移，溶液中游离染料的荧光量子产率较低。直接比较区域异构体MPI和1a的光物理性质表明，两种染料具有相似的吸收波长，而1a的发射波长与MPI相比具有明显的红移，说明1a和1b内的电子转移跨越比MPI更大的共轭π系统。1c和1d在吸收（510和486 nm）和发射（596和572 nm）波长中均显示出明显的红移，可以通过经历电子运动的共轭π系统之间的尺寸差异解释，1c和1d同样显示出86 nm的大斯托克斯位移，T.E.缓冲液中游离染料的荧光量子产率较低。

图3. T.E.缓冲液（pH 1.1）或RNA（来自Torula酵母的IV型RNA;7 μg/ mL）中（a）5c，（b）200d和（c）MPI的吸收和发射光谱。染料浓度：10 μM。虚线和实线分别表示吸收和发射。（d） 缓冲液中 MPI、1c 和 1d 与 RNA 溶液 （200 μg/mL） 染料浓度 10 μM 中的染料之间的荧光强度比较。虚线表示未结合染料的荧光强度，实线表示RNA溶液中染料的荧光强度。（e） 荧光滴定1c（10 μM），与增加浓度的核酸或蛋白质（BSA;牛血清白蛋白）一起培育。

然后，作者使用 1c 和 1d 进行活细胞和固定细胞成像。如图4所示，1c和1d的荧光信号主要在核仁和细胞质内可见，细胞核是暗的，这与染料与RNA的优先结合一致。1c和1d的定位与用MPI染色的HeLa细胞相似。在较高放大倍率下观察1c的荧光图像，本文观察到分布在整个细胞质中的可区分的纤维状结构，类似于线粒体染色谱。该染料在活细胞中成像核仁方面表现出出色的动力学和灵敏度。为了确定染料1c和1d在固定条件下是否显示出相似的定位谱，在用任何一种染料染色之前，用4%多聚甲醛（PFA）固定HeLa细胞。本文发现1c和1d显示出与活细胞成像观察到的定性相似的标记模式，荧光信号主要来自核仁和细胞质。

图4. 用 20 μM MPI （λ_ex= 470 nm， λ_em= 525–555 nm）， 1c （λ_ex= 550 nm， λ_em= 580–620 nm）和 1d （λ_ex= 500 nm， λ_em= 560–600 nm），持续 30 分钟。 TPC：透射相差。比例尺：10 μm。

图5. （a） 用 20 μM 1c 和 1d 和 30 μg/mL Hoechst 1 孵育 33342 分钟孵育 PFA 固定的 HeLa 细胞的共聚焦荧光图像 30 分钟。比例尺：10 μm。（b）用20 μM 1c染色30分钟的HeLa细胞的放大图像。图像显示了亚核仁组分FC（由白色箭头表示），DFC和GC（由白色箭头表示）。TPC：透射相差。比例尺：3 μm。

图6. SYTO RNASelect，1c和1d的光漂白比较。用1c和1d（1 μM）和SYTO RNASelect（1 μM）孵育的PFA固定HeLa细胞的共聚焦荧光图像。比例尺：20 μm。

最后，作者使用1c检测RNA凝聚物，观察到在高离子强度缓冲液中混合RNA和精胺溶液时形成球形凝聚液滴。使用共聚焦荧光显微镜和FLIM观察与1c孵育的凝聚物（图7），强度和FLIM图像都表明，1c很容易分成RNA凝聚，并在RNA密集集中的地方表现出强烈的荧光信号。

图7. 在RNA/精胺缩合物中分配1c（10 μM）。顶行显示放大1倍的图像，而底行显示放大8 倍的图像。左列显示仅基于荧光强度的图像，中间列显示使用FLIM解析的图像。相量图表明存在1c（2.6 ns）的单个生命周期物种。比例尺：10 μm。

综上所述，本文通过改变吲哚供体上的取代位置并用indolizine替换indole，开发了一组新的荧光苯乙烯染料，用于可视化活细胞和RNA凝聚物中的RNA。其中染料1c和1d在结合RNA时显示出高量子产率和显着的荧光增强，与活细胞和固定细胞成像实验兼容，与核染色相容，可以在体外选择性地分配和标记RNA凝聚物，具有良好的光稳定性，并且无细胞毒性。基于这一研究，作者希望通过在苯乙烯支架上加入额外的电子供体和受体来扩展苯乙烯染料库，进而能够选择性地结合特定序列的RNA物种。

本文作者：XNX

原文引用：10.1021/acschembio.3c00141

责任编辑：LD