推荐一篇发表在ACS Chem. Biol.上的文章，文章标题是Synthetic Site-Specific Antibody–Ligand Conjugates Promote Asialoglycoprotein Receptor-Mediated Degradation of Extracellular Human PCSK9。其通讯作者是马里兰大学化学和生物化学系的王来曦教授。课题组工作主要是研究聚糖和糖蛋白的结构和功能。

图1. LYTAC方法中使用的ASGPR配体的合成。

在得到ASGPR配体后，作者通过酶促Fc聚糖重塑对阿利库单抗和西妥昔单抗进行了处理。首先，使用野生型Endo-S2对WT mAb进行脱糖基化，得到GNF-mAb，作为后续转糖基化的受体。然后通过三种不同的酶处理，分别得到三天线N-聚糖修饰的G3F-mAb和具有叠氮基团的di-azido-SCT-mAb和di-azido-Man-mAb，两种叠氮修饰的抗体用于比较配体-抗体距离对hASGPR结合活性的影响。最后，带有叠氮基团的抗体，通过SPAAC反应与ASGPR配体连接在一起，得到LYTAC分子。

图2. 阿利库单抗和西妥昔单抗位点特异性LYTAC的化学酶促合成。

在得到LYTAC分子后，作者通过流式细胞术评估了其在肝细胞表面结合hASGPR的能力。结果发现（图3A），天然的阿利库单抗几乎没有观察到结合，而半乳糖基化的双天线和三天线N-聚糖显示出与细胞表面的强结合。这一结果表明，LYTAC分子与细胞表面ASGPR的结合取决于末端Gal/GalNAc的存在。

图3. 通过ASGPR在HepG2细胞表面识别生物素化LYTAC上的聚糖配体。

在确定了LYTAC分子在肝细胞表面与ASGPR的相互作用取决于末端Gal/GalNAc的存在后，作者研究了基于阿利库单抗的LYTAC降解细胞外PCSK9的能力，通过对培养基进行蛋白质印迹检测来评估PCSK9的降解。结果显示，天然抗体未观察到显著降解（图4A），LYTAC10a和LYTAC 13a也未能降解细胞外PCSK9（图4B），而LYTAC14a在200 nM浓度下可以降解约30%细胞外PCSK9，LYTAC15a在50 nM浓度下可以降解约60%细胞外PCSK9（图4C）。此外，LYTAC15a和LYTAC16a存在钩子效应，在较高浓度下对PCSK9降解减少，而LYTAC14a不存在这种效应。对于LYTAC15a，可能是由于通过较短的聚糖接头连接到较大的IgG的Fc结构域上的Tri-GalNAc配体的可及性较低。

图4. 蛋白质印迹评估LYTAC处理后HepG2培养基的PCSK9水平。

为了确定PCSK9降解对LDLR水平的影响，对细胞的裂解物进行了蛋白质印迹检测。结果显示，外源性PCSK9处理细胞降低了LDLR水平（约20%），在测试的最高抗体浓度下，天然抗体可以使LDLR增加17%（图5A）。相比之下，LYTAC14a处理不会导致LDLR显着增加，而LYTAC15a在50 nM时使LDLR增加40%（图5B）。值得注意的是，该浓度也是LYTAC15a显著降低PCSK9时的浓度，表明PCSK9降解是LDLR增加的原因。

图5. 蛋白质印迹评估LYTAC处理后HepG2细胞裂解物的LDLR水平。

最后，为了证明该方法针对不同蛋白的适用性，使用基于西妥昔单抗的LYTAC用于靶向降解膜结合的EGFR（图6A）。结果显示，天然的西妥昔单抗几乎没有观察到降解，LYTAC10b和LYTAC13b同样未能降解细胞表面EGFR（图6B）。而LYTAC14b在25 nM的浓度下降解30%的EGFR，LYTAC15b在50 nM的浓度下降解45%的EGFR（图6C）。同时，为了证明观察到的降解是ASGPR依赖的，作者对HeLa细胞用天然的西妥昔单抗、LYTAC14b和LYTAC15b进行处理，并没有观察到EGFR的降解（图6D），表明这一过程确实是ASGPR依赖的。

图6. 表皮生长因子受体（EGFR）的降解。