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分享一篇来自宾厄姆顿大学化学系Eriks Rozners教授在JACS上发表的文章，标题是“Chemical Modifications of CRISPR RNAs to Improve Gene-Editing Activity and Specificity”。Eriks Rozners课题组研究方向为通过化学方法来控制调节 RNA 的功能，1.酰胺修饰的 RNA：RNA 干扰的合成、结构和潜力2.通过形成三链体的 PNA 对双链非编码 RNA 的序列选择性识别。
CRISPR (clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats) RNA和Cas (CRISPR-associated)蛋白形成了一种独特的RNA引导的细菌免疫防御系统，用于切割入侵病毒和质粒的DNA。由于CRISPR RNA (crRNA)可以很容易地编程切割几乎任何DNA(或RNA在Cas13中)的靶点，CRISPR−Cas被用于基因编辑，在分子生物学和基因组学中有着广泛的应用，已经成为一个重要而强大的工具。
在众多的Cas9蛋白中，化脓链球菌Cas9 (SpCas9)是研究最多的内切酶，具有建立的目标识别(REC叶，图1)和核酸酶(NUC叶)部分的双叶结构。引导RNA/DNA复合物(图1B和C中的蓝色和黄色)位于REC和NUC叶的界面。
图1
Native Cas9使用两个RNA，一个42核苷酸长crRNA和一个80核苷酸长反式激活crRNA (tracrRNA)，来指导dsDNA的序列特异性识别和切割。crRNA和tracrRNA形成部分互补复合体(图2)，其中crRNA携带的DNA识别序列称为间隔子，和tracrRNA负责与Cas9蛋白关联。在基因组编辑等技术中，常见的是在102个核苷酸长的单导RNA (sgRNA，见图2)中通过GAAA四环将两个RNA连接在一起Cas9 - RNA复合物的DNA结合和切割始于识别一个短的DNA序列，5 ' -NGG-3 '，称为原间隔邻近基序(PAM，其中N可以是任何核苷酸)。Cas9使用两个精氨酸残基对5 ' -NGG-3 '胍基进行序列特异性识别，使CRISPR能够区分具有PAM的外源DNA靶点和自身DNA(存储在CRISPR位点的获得性间隔区)，后者没有PAM。Cas9与PAM结合引发dsDNA的构象放松和解开，首先将PAM-近端核苷酸暴露于间隔区的种子区(约10个核苷酸)，然后在整个20个核苷酸长5 '端crRNA与目标DNA之间进行碱基配对，r -环的形成是一个两步过程，通过一个中间状态进行，只有PAM -近端8 - 12碱基对(种子区)的部分展开种子区域的不匹配破坏了中间状态，强烈地抑制了r环的形成。
图2 r环形成后，Cas9的HNH核酸酶结构域发生构象变化，最终达到催化活性的对接态(D态)。HNH只有在D态对接后才会对目标链进行切割，而RuvC核酸酶结构域则会将被置换的非目标链在PAM上游3个碱基对处进行切割(图2)。HNH结构域的构象变化对RuvC结构域核酸酶活性进行变构控制;两条DNA链同时断裂分子动力学模拟表明，变构控制从PAM结合激活HNH和RuvC结构域开始，然后是靶位点和脱靶位点的DNA切割的变构控制。因此可以利用crRNA的化学修饰来调节Cas9的特异性。 1. 用DNA替代核糖核苷酸是最简单和最有效的crRNA修饰之一。DNA比RNA更便宜、更容易合成、在生物介质中更稳定，这些都是crRNA/DNA嵌合体的明显优势。结果显示在小鼠Hepa1-6肝细胞或人HEK293细胞中没有检测到脱靶活性。 2. Cas9 crRNA的核糖修饰:2 ' -F, 2 ' OMe和双环核糖：这些修饰有一个共同的优势，即对互补核酸的亲和力增加。 3. Cas9 crRNA 的磷酸盐骨架修饰。用硫取代非桥连磷酸氧会产生硫代磷酸酯核苷酸间键（PS，图 3）， 这是反义寡核苷酸和 siRNA 中最广泛使用的修饰之一。PS 修饰易于合成，提高酶稳定性，但会降低修饰的寡核苷酸用于它们的互补靶标。PS 的一个主要优点是它们增加了寡核苷酸与血浆蛋白的结合，从而通过减慢肾脏排泄显着改善了它们的药代动力学。有限的 PS 修饰在治疗性 DNA 和 RNA 中具有良好的耐受性，并提高了它们的代谢稳定性、递送和生物利用度；然而，广泛的 PS 修饰可能会导致毒性。 4. 核糖和磷酸结合修饰：通过结合各种糖和主链化学物质对crRNA 进行广泛的修饰。 综上所述，上述研究证明了化学修饰在优化CRISPR效率和特异性方面的潜力。 本文作者：ZLQ 责任编辑：WQX DOI: 10.1021/jacs.2c02633 原文链接：https://doi.org/10.1021/jacs.2c02633
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