今天为大家介绍的是在ACS Cent. Sci.上报道的一篇标题为 “Site-Specific Bioconjugation through Enzyme-Catalyzed Tyrosine−Cysteine Bond Formation” 的文章。该文的通讯作者是加利福尼亚大学伯克利分校的Christof Fellmann教授、Jennifer A. Doudna教授和Matthew B. Francis教授。Matthew B. Francis教授一直在生物有机化学领域颇具建树，尤其是位点特异性的蛋白质修饰方法的研究。本工作中， Francis课题组再次报道了新型位点特异性的生物偶联反应。

扩展蛋白与蛋白或多肽的偶联方法对新型疫苗开发、免疫疗法和药物靶向递送等领域具有重要作用。目前，可控制位点、反应条件温和且产物稳定的偶联方法，当属自然化学连接反应（NCL）和分选酶介导连接反应（SML）。但是这两种方法只能对蛋白质的N末端或C末端进行修饰，其中SML还需要对蛋白质C末端的接头长度进行设计和筛选。因此，开发广谱性位点特异蛋白修饰反应成为新挑战。

在之前的工作中，Francis课题组发现，带有苯胺或N-末端脯氨酸的蛋白可以在含苯酚结构化合物的作用下高产率地修饰上邻苯醌或邻亚氨基醌。但是这些反应需要通过高碘酸盐等强氧化剂进行氧化，容易造成蛋氨酸和半胱氨酸氧化等副反应。

事实上早在1967年，人们就发现利用酪氨酸酶作用于酪氨酸残基，可实现蛋白质交联。近两年，Francis课题组发现了酪氨酸酶abTYR，它利用水溶液中的溶解氧就可以氧化蛋白质中的酚，从而与N-末端脯氨酸残基或苯胺偶联。这个反应避免了强氧化剂的剧烈反应条件，减少了副反应的发生。

但是这两种abTYR介导的反应需要高当量的N-末端脯氨酸残基或苯胺，对蛋白和蛋白之间的偶联造成阻碍，使该方法局限于蛋白和多肽的偶联。而在本文中，Francis课题组再做突破，他们发现半胱氨酸的巯基，可以低当量参与abTYR介导的蛋白偶联反应，且可使蛋白和蛋白之间顺利偶联（图1）。 

图1. Francis课题组报道的酪氨酸酶介导的生物偶联反应

首先，他们对MS2（N87C突变）噬菌体衣壳蛋白进行了模型反应。突变后的蛋白含有一个半胱氨酸残基，且会组装形成噬菌体衣壳。然而在高度空间拥挤下，95%以上的衣壳蛋白单体均在酪氨酸酶abTYR的催化下在30 min后修饰上了端基为酪氨酸的α-内啡肽，可见该反应的高效性。每个蛋白修饰一条多肽。随后用半胱氨酸加帽试剂N-乙基马来酰亚胺（NEM）未见进一步修饰，可见该反应的半胱氨酸选择性（图2）。

图2. 酪氨酸酶介导的酪氨酸-半胱氨酸偶联反应的选择性

为了表征偶联产物的化学结构，作者对小分子类似物进行了核磁表征。ROESY ¹H NMR结果表明，产物是由邻苯醌环5位与巯基加成而得，主要以邻苯二酚的形式存在。这与酪氨酸氧化后和苯胺反应形成的醌不同，酚产物更稳定。DFT计算结果也表明，醌与苯胺反应产物倾向于以醌形式保留，与硫醇加成产物主要以还原的儿茶酚形式存在，与核磁结果相符。因此，本工作中的偶联产物可以经受强还原剂如谷胱甘肽、巯基丁醇而保持稳定。

图3. 醌与硫醇反应的核磁分析与DFT计算

最后，作者将这种偶联方法用于功能型蛋白的修饰。Cas9是一种RNA导向的DNA核酸内切酶，广泛用于基因组编辑，在位置80和574处包含两个表面半胱氨酸。利用细胞穿透肽2SV40可促进Cas9细胞核递送以提高基因编辑效率，但将它们融合通常需要基因编辑和漫长的生产周期。但利用酪氨酸酶介导的Tyr-Cys偶联反应可便捷地对Cas9进行2SV40修饰，结果显示Cas9-2SV40基因编辑效率提高了20倍。不仅如此，作者通过此反应用带Tyr的HER2结合抗体片段（scFv）与2当量的表面带Cys的绿色荧光蛋白（GFP），实现了低当量的蛋白-蛋白偶联反应，且不影响scFv对HER2⁺癌细胞的结合活性。

总的来说，Francis课题组利用新型酪氨酸酶abTYR介导的Tyr与Cys位点特异性偶联反应，可用于蛋白与多肽或蛋白之间的有效偶联反应。Cys可以是蛋白质表面的任一位点，该反应条件温和，不需强氧化剂，偶联产物稳定。作为一种新型有效的位点特异性生物偶联方法，相信它在生物医药领域将具有很好的应用前景。

作者：SJL 审校：ZHS

DOI: 10.1021/acscentsci.0c00940

Link: https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acscentsci.0c00940