给大家分享一篇发表在Angew. Chem.Int. Ed.上的文章，题为：Constructing Photoactivatable Protein with Genetically Encoded Photocaged Glutamic Acid。本文的通讯作者是来自天津大学的轩维民。

    光通常被认为是一种理想的外部刺激，可以无创地隔空触发活细胞中的特定生物事件。为此，利用天然存在的感觉感光蛋白的光遗传学方法，和利用各种光可去除基团的合成方法引起了人们的广泛关注，促进了光响应小分子、核酸和蛋白质的设计与应用。

    遗传密码扩充（GCE）技术能够将非天然氨基酸（ncAA）定点掺入蛋白质中，为光学控制活细胞中的蛋白质功能提供了新的设计思路。例如目标蛋白质可以通过GCE策略突变为其光笼类似物，以完全抑制蛋白质活性。在光照射下，可以选择性地去除笼蔽基团，从而释放出天然形式的蛋白质。然而，通过GCE构建光笼蛋白仍然依赖于活性位点内或附近的半胱氨酸（Cys）、丝氨酸（Ser）、酪氨酸（Tyr）或赖氨酸（Lys）残基的存在，不可避免地限制了应用范围。

    本文作者尝试丰富基因编码库。谷氨酸（Glu）经常出现在蛋白质的活性位点，在质子转移、酸碱催化和静电相互作用中发挥重要作用。因此，开发Glu的光笼类似物能为光激活蛋白的开发带来更丰富的选择。首先，作者设计了如图1A所示的两种光笼L-谷氨酸类似物ONBE和NPE。以绿色荧光蛋白（GFP）为基础，两者的掺入均能显著增强荧光强度（图1B）。随后通过SDS-PAGE（图1C）和ESI-QTOF质谱（图1D）进行分析。

图1. 大肠杆菌中基因编码ONBE和NPE

    接下来，作者研究了ONBE和NPE是否可以在哺乳动物细胞中进行遗传编码。在HEK293T细胞中，利用ONBE和NPE表达EGFP突变体（Tyr39TAG）。如图 2A 所示，只有在2 mM ONBE或NPE存在的情况下才能观察到亮绿色荧光，表明转染细胞中全长 EGFP 的产生依赖于 ncAA。与细菌中的结果一致，ONBE 的掺入效率远高于NPE。通过ESI -QTOF质谱法验证ncAA的掺入和完整性（图 2B）。

图2. 哺乳动物细胞中基因编码 ONBE 和 NPE

    可光激活的荧光蛋白是备受追捧的分子探针，用于光学标记和跟踪生命系统中的目标蛋白。E222是GFP中的保守残基，在发色团形成过程中发挥重要的静电相互作用。因此，作者尝试通过用ONBE替换E222来生成光可激活GFP变体（图 3A）。紫外线照射后，前2小时内出现时间依赖性荧光增强（图3C）。最终产物的ESI-QTOF分析揭示了笼蔽基团的去除和发色团的形成（图3B）。在HEK293T细胞中表达变体GFP，证明其在哺乳动物细胞中的光激活作用。如图3D所示，红色荧光表示融合蛋白的全长翻译和膜定位，观察不到绿色荧光，在紫外线照射后逐渐增加绿色荧光。这些实验验证了光笼Glu在直接有效生成可光激活的GFP变体方面的应用潜力。

图3. 通过编码ONBE设计可光激活的GFP变体

    此前，光笼Tyr已被用于通过替换发色团形成Tyr66来生成可光激活的GFP。然而，对于发射较短波长的荧光蛋白，例如蓝色荧光蛋白（BFP）和青色荧光蛋白（CFP），保守的Tyr66分别突变为His和Trp，从而限制了光笼Tyr在这些情况下的使用。由于E222在源自维多利亚水母或珊瑚的荧光蛋白中高度保守，因此作者推断可以使用ONBE将一系列荧光蛋白轻松转换为可光激活的变体。为了证明这一点，作者在相应的Glu处编码ONBE来表达BFP、CFP、黄色荧光蛋白（YFP）和mCherry的可光激活变体，紫外线照射可导致荧光明显增加。因此，基因编码的Glu扩大了GCE技术可实现的光激活荧光蛋白的范围。

    最后，作者注意到SpyTag/SpyCatcher这种广泛使用的共价分子组装工具。在此系统中，SpyCatcher中的关键Glu（E77）能够催化SpyCatcher中的Lys和SpyTag中的Asp之间形成异肽键。作者用ONBE取代E77，再将SpyTag融合到sfGFP的N末端。如图4A所示，SpyCatcher-E77ONBE无法与SpyTag-sfGFP缀合，表明E77可以作为有效的笼蔽位点。当样品受到紫外线照射时，SDS-PAGE凝胶上出现大量偶联物。如图4B所示，仅当应用UV照射时，表达SpyCatcher-E77ONBE的细胞才能被SpyTag-sfGFP染色。

图4. 通过编码ONBE构建可光激活的SpyCatcher

    综上所述，作者设计了光笼谷氨酸类似物，并将其整合到大肠杆菌和哺乳动物细胞的蛋白质中。这种策略可以直接有效地产生活性依赖于谷氨酸的光活化蛋白质，从而丰富了基因编码的光笼氨基酸的工具箱。

作者：HYH  审校：LXY

DOI: 10.1002/anie.202308472

Link: https://doi.org/10.1002/anie.202308472