今天为大家分享一篇近期发表在Bioconjugate Chemistry上的研究进展，题为oxSTEF Reagents Are Tunable and Versatile Electrophiles for Selective Disulfide-Rebridging of Native Proteins。这篇文章的通讯作者是奥尔胡斯大学化学系的Thomas B. Poulsen。

    天然蛋白质或寡肽的结构修饰具有调节其生物功能的作用。蛋白质化学修饰生成的偶联物可能具有更加多样的性质，例如引入用于成像的的生物正交柄或荧光团，或与药物分子偶联从而得到大分子药物，如抗体偶联药物(ADC)。如图1A所示，蛋白质表面暴露的二硫键可以通过原位还原反应与非天然连接子偶联而引入功能化位点。此外，相比于其他偶联方式，二硫键桥连形成的蛋白质偶联物通常可以保留原有生物功能，并且可以根据环境条件可逆转变。因此，开发新试剂来进一步提高这种选择性生物偶联方式的范围与灵活性是目前值得关注的研究方向之一，尤其是开发结构灵活可调且修饰前后结构偏差尽可能小的试剂。

    以往工作中，作者已经报道了STEF类亲电试剂——一种半草酰胺乙烯基硫醚化合物——与天然蛋白质或寡肽的反应。本文中，作者在原有STEF化合物上引入额外的硫取代基，期望该试剂能够通过两次硫醇交换反应实现仅单原子桥连偶联过程(图1B)。

图1. 二硫键桥连示意图以及本文工作改进方法

    作者从1,1-双(甲硫基)乙烯1出发，在低温下与草酰氯以及炔基胺2反应合成了oxSTEF试剂3，同时还可以合成芳基与烷基混合取代的双硫化物5。这种双硫化物的甲硫醚基团可以被过氧单磺酸钾选择性氧化为亚砜6，随后通过硫醇取代反应可以拓展出空间位阻以及电子分布特征多样化的oxSTEF试剂7-10。这些化合物在酸性(pH=4)和中性(pH=7)条件下几乎均能稳定存在长达7小时，而在碱性条件下(pH=10)下活性相对较高的7和8短时间内也只有部分程度的转化。

图2. oxSTEF试剂的合成方法

    随后，作者研究了oxSTEF试剂与奥曲肽、兰瑞肽和鲑鱼降钙素三种大环肽的反应活性，这些大环肽具有Thr、Ser、Lys以及N末端等潜在的反应位点。如图3所示，LC-UV-MS监测结果表明，oxSTEF无法直接与这些大环肽形成偶联物，但是当三(2-羧乙基)膦(TCEP)存在时，oxSTEF可以与这些大环肽形成预期的偶联物，并且即使反应更长时间，体系中也不会发生其他副反应。此外，作者还发现除了二硫键桥连外，oxSTEF试剂还有望用于位点选择性的N端Cys残基修饰。

图3. oxSTEF试剂与大环肽中的二硫键桥连示意图

    如图4A-C所示，作者以人类生长激素(hGH)和溶菌酶作为模型研究了天然蛋白中二硫键与oxSTEF试剂的反应效果。结果表明，TCEP存在时hGH与oxSTEF试剂共孵育后可以得到单一偶联物，并且溶菌酶的oxSTEF偶联物基本能够保留其原有酶活性。此外，当α-二羰基结构替换为羰基后，其便完全失去了反应活性，证明α-二羰基结构在oxSTEF试剂与二硫键的反应起到核心驱动作用。

    为研究oxSTEF偶联物选择性释放货物分子的潜力，作者测试了溶菌酶-oxSTEF偶联物分别在癌细胞内外的稳定性，两种条件下谷胱甘肽(GSH)的浓度有显著差异(细胞外：~20 μM；细胞内：~1 mM)。如图4D所示，结果表明偶联物在20 μM条件下基本保持稳定，而在1 mM条件下孵育24小时后则会呈现基本完全裂解(>80%)。

图4. oxSTEF试剂与天然蛋白的偶联

    总的来说，作者在原有STEF试剂研究基础上优化得到了化学结构更为灵活，并且偶联前后结构扰动更小的oxSTEF试剂。这种化合物在TCEP存在时能够与二硫键选择性反应偶联，从而引入末端炔烃基团，有利于蛋白或寡肽后续进行进一步功能化修饰。同时，这种oxSTEF分子接头还可以在高浓度GSH条件下裂解，释放出母体蛋白，为蛋白药物的可控释放提供了新的途径。

作者：QJC  审校：SYM

DOI: 10.1021/acs.bioconjchem.3c00005

Link: https://doi.org/10.1021/acs.bioconjchem.3c00005