今天与大家分享一篇近期发表在JACS上的文章，题为Tyrosinase-Catalyzed Peptide Macrocyclization for mRNA Display。文章的通讯作者是美国北卡罗来纳大学教堂山分校的Albert A. Bowers。

    酪氨酸酶是一种铜依赖的氧化酶，能够将酪氨酸的苯酚残基氧化为邻苯醌，从而具备与硫醇的反应活性。前期工作中已有研究人员利用该反应实现了蛋白质的偶联，本工作对该偶联方法做了进一步的拓展，证明含有酪氨酸和半胱氨酸的多肽在酪氨酸酶处理后可迅速环化，且该环化方法广泛适用于多种场景（图1）。

    mRNA展示技术是一种将基因型（mRNA）与表型（蛋白质）融合的体外多肽/蛋白质筛选技术，可用于发现生物分子配体，分析生物大分子相互作用。作者将该方法与mRNA展示技术结合，成功制备了大环化mRNA-蛋白质偶联物，用于开发靶向黑色素瘤相关抗原的环状配体。

图1.  酪氨酸酶介导的多肽环化

    环化在一定程度上可以对多肽链的构象起到固定作用，使多肽链预组织成具有高亲和力的结合构象，有助于提高偶联物的稳定性和细胞通透性。如图2所示，作者首先使用megTYR酪氨酸酶和一个包含N端酪氨酸和C端半胱氨酸的模型肽在体外测试了环化的可能，并通过氘代酪氨酸苯环上的氢，用质谱方法确定了环化反应的位点选择性——C5和C2产物的比例为2.8：1。通过在反应体系中添加BME，作者确认环化反应是充分的，环化后没有邻苯醌剩余；其他亲核性氨基酸如丝氨酸或赖氨酸在相同条件下不会发生环化。

图2. 体外模型肽环化实验

    作者采用相似的同位素质谱分析方法，探究了活性氨基酸的相对位置对环化反应的影响（图3A），实验证明该反应支持生成3-12个残基的大环，酪氨酸和半胱氨酸的相对位置对反应的影响不大，但酪氨酸苯环的修饰则会影响酪氨酸酶的反应效率。接下来，作者使用mRNA末端的酪氨酸与生物素硫醇的偶联验证酪氨酸酶与mRNA展示技术的相容性，在酪氨酸酶的存在下，RNA文库可以剂量依赖的方式与生物素硫醇反应，作者选择使用125 nM酪氨酸酶处理文库并进行测序，以揭示环化反应对多肽底物的偏好（图3B-E）。实验结果证明分子内偶联优先于分子间偶联，脯氨酸直接与酪氨酸相邻会阻碍反应进行，带有负电荷的氨基酸与酪氨酸相邻会促进反应进行，总的来说该反应具有较高的底物容忍度。

图3. 环化反应的底物选择性实验

    最后，作者使用该大环化技术应用于开发靶向黑色素瘤相关抗原（MAGE-A4）的识别配体（图4）。作者设计了一个多肽文库，其中多肽长度为10-12个残基，N端为酪氨酸，C端为半胱氨酸，并应用mRNA展示技术筛选该文库，经过四轮筛选，作者最终成功得到了两类环尺寸不同的识别配体，其中大环配体的序列与前人研究中筛选的MAGE-A4抑制剂序列高度相似，且半数抑制浓度在纳摩尔水平，显著高于相同序列的线性多肽，证明了该环化策略的可行性。

图4. 大环化方法应用于筛选抗原识别配体

    总的来说，本文开发的环化策略为mRNA展示技术提供了一种新的有力工具，可以与多种底物反应，具有良好的mRNA相容性，作者利用该方法成功高效地筛选得到了新的MAGE-A4多肽抑制剂。

作者：SYM  审校：WLT

DOI: 10.1021/jacs.2c12629

Link: https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.2c12629