活细胞内游离氨基酸荧光成像工具

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今天给大家分享一篇发表在ACS Cent. Sci.上的文章，题为：A Turn-On Fluorescent Amino Acid Sensor Reveals Chloroquine’s Effect on Cellular Amino Acids via Inhibiting Cathepsin L。本文的通讯作者是来自密苏里大学的Timothy E. Glass和来自康乃尔大学的Hening Lin。

氨基酸稳态对细胞维持各项功能十分重要，稳态失调可导致各类疾病，包括枫糖尿症、智力低下和过早死亡等。因此，细胞进化出了不同的信号和调节机制，例如 mTOR和GCN2信号通路，以感知和调节氨基酸的摄取与利用。在氨基酸匮乏等应激条件下，氨基酸传感中枢mTORC1活性下调，翻译受到抑制，细胞会通过一系列应激反应机制进行适应。

溶酶体是重要的氨基酸传感和储存库，负责自噬体、线粒体和其他受损细胞器的降解。自噬抑制剂，如巴弗洛霉素A1、氯喹和氯化铵，则会破坏这些功能。例如巴弗洛霉素A1（BafA1）可以抑制液泡（H⁺）-ATP酶（这种酶对于维持溶酶体和晚期核内体的低pH值至关重要）。抗疟药氯喹（CQ）和氯化铵（NH₄Cl）可以跨越溶酶体膜，在溶酶体中被质子化并积累，通过质子海绵效应使细胞功能失调。尽管氯喹已经被广泛用作抑制自噬的工具，癌症治疗和SARS-CoV-2疗法的也均在临床试验中，但其作用机制仍未得到充分了解。

为了研究氨基酸的摄取、储存和利用，研究人员需要借助高分辨率的、可视化的手段来监测活细胞中的氨基酸。目前已开发了许多基因编码的生物传感器，利用荧光共振能量转移（FRET）来监测单个代谢物。例如OLIVe系统（用于检测亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸的光学生物传感器），使用YFP/CFPFRET技术来检测支链氨基酸。但这种方法无法检测单个细胞器中的氨基酸。许多研究都集中在谷氨酸传感器来研究神经元中的突触传递，但也缺乏能够定位细胞器的分辨率。组氨酸或半胱氨酸传感也遵循类似的模式。然而，这些方法均受到一定的限制，如过表达传感域的定位和低相对开启信号。除此以外，为最终代谢组学富集和纯化溶酶体是一种定量方法，但并不能作为活细胞的显微成像工具。

本文作者报道了一种新型泛氨基酸荧光传感器——NS560。这是一种喹诺酮类荧光团，带有一个醛基和一个硼酸官能团，可以与氨基酸发生反应。苯硼酚酯在生理pH值下易水解。与氨基酸反应后，醛转化为亚胺离子，具有长波长吸收（图1A）。虽然孤立的羧酸盐基团通常不会有利地形成硼酸酯，但距离的靠近会促进NS560形成酯键。同时，氨基酸与NS560形成的大环限制了芳基硼酸的旋转，由此影响分子的荧光特性（图1）。从图1C中可以看出，除脯氨酸和色氨酸外，所有荧光增强都大于35倍。脯氨酸缺乏增强作用，是由于末端二级胺的亲核性较弱。而色氨酸的吲哚环在与NS560反应后会发生荧光淬灭。因此，NS560是一种体外泛特异性氨基酸探针，能够识别20种蛋白氨基酸中的18种。