给大家分享一篇近期发表在JACS上的研究进展，题为：A Reactive Oxygen Species-Scavenging ‘Stealth’ Polymer, Poly(thioglycidyl glycerol), Outperforms Poly(ethylene glycol) in Protein Conjugates and Nanocarriers and Enhances Protein Stability to Environmental and Biological Stressors。在该工作中，作者着眼于蛋白质聚乙二醇化（PEGylation）存在的缺点，开发了聚乙二醇的替代物聚硫代环氧丙基甘油（PTGG），后者除免疫原性更低外，还具有清除活性氧物种和抗炎的功能。该工作的通讯作者是来自美国Vanderbilt University的Richard d’Arcy和英国University of Manchester的Nicola Tirelli。 过去几十年中，蛋白质药物疗法大大改变了医药领域的格局。天然蛋白在应用到动物体内时，往往存在理化稳定性（氧化、冻干、温度和pH稳定性）、免疫原性和药代动力学不理想的情况。聚乙二醇化是改善蛋白质药学性质的常用策略，可以显著延长蛋白的血浆半衰期并改善生物分布。由此，至今已有26款聚乙二醇化蛋白质药物获批上市，构成了数十亿美元的巨大产业。然而，聚乙二醇化也存在明显的不足。PEG自身的免疫原性导致的超敏反应（hypersensitivity reactions）和加速血液清除（accelerated blood clearance，ABC）引起了越来越多的关注。这导致了pegnivacogin（Revolixys）临床研究的暂停，以及peginesatide（Omontys）和pegloticase（Krystexxa）的市场召回。并且，Covid-19疫苗中PEG脂质的大量使用，显著提高了人群的anti-PEG抗体水平，为PEG化药物的未来提供了更多的不确定性。此外，也有研究表明PEG化药物的应用也与多种器官细胞空泡化有关。因此，生物可降解的低免疫原性PEG替代物为临床所急需。 PEG化的另一个不足在于，PEG聚合物链本身无法为蛋白提供恶劣条件（冻干、长期储存、氧化等）下的变性保护。受聚亚砜类聚合物抗氧化性质的启发，作者设计了亲水的模拟甲硫氨酸的聚硫醚类聚合物——聚硫代环氧丙基甘油（PTGG，图1）。聚硫醚的主链有望带来清除活性氧物种（ROS）的能力；甘油侧链可提供良好的抗污性能，使聚合物在生物体内隐形（stealth），并且可能在冷冻或冻干条件下保护蛋白质。 首先，在合成方面，作者合成了侧基甘油被缩醛保护的环硫醚单体，在苯硫酚引发剂和DBU催化下开环聚合得到聚硫醚PTGS，最后使用酸性离子交换树脂脱保护得到PTGG（图1）。SEC表征显示，聚合度为30的PTGS30和分子量为5 kDa的PEG单甲醚（mPEG-OH）具有接近的流体力学半径。 接下来，作者评价了不同尺寸的PTGG30和PEG-5k两种聚合物的生物相容性。细胞毒性实验表明，PTGG和PEG在5 mg/mL以下的浓度均未表现出明显毒性（图2）。作者选取的细胞为吞噬细胞RAW，因为该类细胞对毒性更敏感。细胞摄取方面，PTGG和PEG表现非常接近，均显著低于阳离子葡聚糖阳性对照组，表明PTGG进入细胞的途径主要为非特异性摄取。补体激活方面，PTGG低于PEG，过敏毒素C3a和C5a水平分别低23%和35%（图3）。
图2.细胞毒性实验
图3.人血清的补体激活实验
PTGG在设计上的特色之一在于ROS的清除能力。作者选取有代表性的过氧化氢和次氯酸根两种ROS，在使用脂多糖LPS活化吞噬细胞RAW后，观察聚合物的引入对ROS浓度的影响（图4）。结果表明，PEG不会影响ROS的浓度，而PTGG则可显著降低ROS浓度（对次氯酸根的降低更明显）。 在表征了PTGG聚合物的性质后，作者着手将PTGG偶联在蛋白质上。溶菌酶（lysozyme）是蛋白质高分子偶联物的标准模型蛋白，作者使用马来酰亚胺-活化酯双端连接单元BMPS成功分别将PTGG和巯基末端的PEG与溶菌酶共价连接，制备了两种偶联物（图5）。两种聚合物的偶联效率不尽相同，作者通过调整投料比，使溶菌酶上PTGG和PEG均平均修饰2.5条链。 高分子偶联通常会降低蛋白的活性（酶活），而作者对溶菌酶偶联物的分析显示，PEG和PTGG60会显著降低酶活，而更短的PTGG30则对酶活没有明显影响。作者认为，PTGG位阻更大的侧链使得PTGG比PEG的卷曲程度更低，因此对蛋白活性位点的遮蔽更小。此外，作者也发现PTGG30/Lys偶联物有良好的冻干稳定性，冻干十次后活性仅降低20%（无偶联则降低71%），而PEG偶联物则降低66%。作者将PTGG出色的冻干保护作用归于多羟基的存在。 高分子偶联的重要功能之一是降低蛋白的免疫原性。作者使用抗溶菌酶抗体分别作用于溶菌酶、PTGG30/Lys和mPEG/Lys，以评价它们的免疫识别情况（图6）。结果表明，两种偶联物都基本消除了单克隆抗体的结合，而多克隆抗体的结合水平则均有明显的下降。这说明在免疫识别方面，PTGG的保护效果和PEG相当。随后，作者也表征了PTGG保护溶菌酶免受蛋白酶解和ROS氧化的能力，后者源于硫醚的牺牲氧化。 最后，作者在小鼠和大鼠体内研究了PTGG偶联物的药代动力学。PTGG-卵白蛋白的循环半衰期可比PEG组高出至多两倍，并且更重要的是，PTGG组未观察到PEG存在的ABC效应。作者还将PTGG化的脂质应用于脂质体纳米载体的构建，表现出了和PEG化脂质相近的药代动力学。综上，作者开发了侧基为甘油的聚硫醚PTGG作为潜在的PEG替代材料，PTGG免疫原性低于PEG，并且具有PEG所不具有的抗氧化和抗炎活性，以及保护蛋白免受冻干失活的功能。DOI: 10.1021/jacs.2c09232Link: https://doi.org/10.1021/jacs.2c09232
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