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分享一篇近期发表在Biomacromolecules上的文章，Smart Protein Refolding System Based on UCST-Type Ureido Polymers。这篇文章的通讯作者是日本东京工业大学生命理工学院的Naohiko Shimada教授和Atsushi Maruyama教授。
至今为止，蛋白质的产量足以支撑各类应用场景，但是不溶性聚集体的形成会导致蛋白质产率偏低。分子伴侣(molecular chaperones)是一类协助蛋白质折叠和细胞内分子组装和的蛋白质，但它并不适用于大规模生产，而与之作用相似的人工分子伴侣便可用于大规模生产蛋白质。例如，具有低临界溶解温度(LCST)的热响应性聚合物被用于在高于LCST下通过疏水相互作用来捕获变性蛋白质，然后在低于LCST时再将蛋白质释放，最后通过色谱等分离技术从蛋白质-聚合物混合物中分离出复性蛋白质。例如，接枝至固相载体上的聚合物已被用于促进分离复性蛋白质，然而由于该过程为固-液相反应同时蛋白质与固相载体为非特异性结合，分离过程较为缓慢并且蛋白质的释放也并不可控。
已有研究表明，脲基聚合物在生理条件下具有高临界溶解温度(UCST)，并且冷却后会发生液-液相分离(LLPS)而形成凝聚液滴。本文中，作者证明了被脲基聚合物捕获的变性蛋白质可以通过冷却诱导的LLPS释放而诱导重折叠，同时通过低温离心可以很容易分离出复性蛋白质。
首先，作者合成了各种疏水基团修饰的乙烯胺-乙烯脲共聚物(PVU)(图1)，并评估了修饰对热响应性的影响。如图2所示，结果表明未改性的PVU(PVU-A)在5~60 ℃范围内没有表现出相分离行为，而修饰有2.3 mol %十一烷基的PVU(U2PVU)则表现出UCST型溶液行为，同时修饰度为3.8 mol %(U4PVU)或6.0 mol %(U6PVU)的PVU则具有更高的相转变温度。此外，修饰苯基(P6PVU)或苯己基(Ph4PVU)的PVU同样表现出UCST型溶液行为。
图1. 带有疏水基团的PVU结构式
图2. 不同PVU(5 mg/mL)在含有100 mM NaCl的10 mM HEPES*-NaOH(pH 7.5)溶液中的分光透过率曲线
随后，作者研究了该脲基聚合物对碳酸酐酶B(CAB)热诱导聚集行为的影响。如图3所示，加热后所有样品中只有U2PVU或U4PVU存在时才未产生沉淀，表明十一烷基修饰的PVU可以捕获热变性的CAB以防止聚集。
图3. 45 ℃下含有100 mM NaCl的10 mM HEPES-NaOH(pH 7.5)溶液中的CAB样品图像(上)以及在70 ℃下加热后的图像(下)
为确定CAB是否能从十一烷基修饰的PVU中自发释放，作者将样品在70 ℃下加热，随后在30 ℃下孵育，最后在4 ℃下离心收集上清液并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行量化。如图4所示，结果表明在含有U4PVU或U2PVU的样品上清液中可以明显检测到CAB，并且CAB含量随孵育时间增加而增加。同时，上清液中只观察到非常少的U4PVU和U2PVU，表明大部分聚合物与蛋白质分离。此外，作者还发现上清液的酶活性与孵育时间呈正相关，甚至在U4PVU存在下孵育48小时的样品上清液中CAB的CD光谱与天然CAB非常类似，因此证明从聚合物中释放的CAB成功实现了复性过程。
图4. (A-D)4 ℃下样品离心后上清液的SDS-PAGE分析结果。(E)样品上清液中CAB的相对含量与30 ℃下孵育时间的函数关系
作者进一步研究了PVU的热响应性LLPS行为对CAB复性的影响，发现各样品上清液中CAB活性达到最高时的温度均接近相分离温度，并且当盐浓度为25 mM时，U4PVU未表现出LLPS行为，相应样品的酶活性也低于40 %，表明聚合物的LLPS可以促进CAB复性过程。
基于以上结果，作者认为十一烷基修饰的PVU可以防止蛋白质聚集并通过依赖于LLPS的机制促进蛋白质重折叠(图5)。具体而言，当体系温度高于相转变温度但低于CAB变性温度时，PVU和CAB之间形成的复合物与游离的CAB处于转化平衡状态，而处于平衡状态的游离CAB可以自发地重新折叠实现复性，并且复性的CAB不会与PVU再相互作用。此外，作者认为当温度低于相转变温度时，PVU会因LLPS产生凝聚液滴而将CAB排出，而当温度高于相转变温度时，CAB则通过氢键或静电相互作用留在PVU中，因此聚合物的LLPS可以进一步促进PVU释放CAB。
图5. 疏水化脲基聚合物诱导蛋白质折叠的可能机制
总的来说，作者成功设计并制备了一种十一烷基改性并且具有UCST型相分离行为的PVU共聚物，发展了一种基于UCST型聚合物的智能分子伴侣系统。该系统能够通过温度变化实现蛋白质的重新折叠与分离从而提高蛋白质的产量，并且有望简化用于工业和研究用途的酶的回收过程。
作者：QJC 审稿：ZHS
DOI: 10.1021/acs.biomac.2c00694
Link: https://doi.org/10.1021/acs.biomac.2c00694
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