为大家分享一篇发表在JACS上的文章Peptides Selected by G4-mRNA Display-Seq Enable RNA G‑Quadruplex Recognition and Gene Regulation，通讯作者是香港城市大学化学系的郭俊杰副教授。郭俊杰课题组主要从事RNA功能相关的研究。

在RNA分子中，一些富含鸟嘌呤(G)的序列可以组装形成一种非经典RNA二级结构，即G四联体(G-quadruplexes, G4s)，并被Na+、K+等金属阳离子稳定。已有研究表明，G4s广泛参与多种生理及病理过程的调控过程，因此是临床治疗上重要的潜在靶点。目前已发展出特异性结合G4的小分子和抗体，然而，上述分子不能有效区分RNA G4s (rG4s)和DNA G4s (dG4s)。因此本文作者基于mRNA展示技术，建立了 G4-mRNA display-Seq，用于发现G4特异性结合肽段。

 本文使用人源端粒酶(hTERC)基因编码RNA中的rG4作为模型rG4。首先，作者构建了一个随机文库，其3'末端均带有linker序列。在文库转录后，向其中加入连有linker互补序列的puromycin，再进行体外翻译(IVT)，即可将所合成的肽段经puromycin与编码的mRNA序列共价连接。作者合成了连有生物素的hTERC rG4分子，在与肽段库共孵育后，使用链霉亲和素磁珠进行富集。六轮筛选后，对富集得到的cDNA文库进行高通量测序，并对筛选所得肽段与hTERC rG4分子之间的相互作用进行测量。其中，Pep11具有最强的结合能力，并且表现出针对 rG4s的偏好性。

为进一步提高Pep11的结合能力，作者分别构建了串联Pep11、环状Pep11。结果表明，上述变化都可以提高结合力，但与之相对的是其结合特异性表现出了一定程度的下降。对Pep11与hTERC rG4之间的互作机制进行探究，作者揭示Pep11中正电性的氨基酸残基对结合具有较大贡献，同时，结合前后，hTERC rG4的构象并未发生明显改变。

 将带有不同荧光团的Pep11与hTERC rG4共同转染进入活细胞中，两者可表现出明确的共定位特征，证实上述相互作用在活细胞中仍能得到忠实的维持。为探究Pep11及其衍生物在调控hTERC rG4功能中的潜在应用，作者构建了双荧光素酶报告基因系统，其中，hTERC rG4插入到海肾荧光素酶的5'-UTR中。与突变体相比，hTERC rG4本身将使得荧光素酶活性降低2.34倍，在加入100/200 nM的Pep11及其衍生物后，荧光素酶活性可进一步降低，表明Pep11在活细胞体系中与hTERC rG4的结合将进一步抑制基因的翻译。

综上所述，本文建立了G4-mRNA display-Seq技术，以hTERC rG4为模型，筛选得到结合力较强的结合肽，并将其应用于活细胞中该rG4功能的调控。

本文作者：TZS

责任编辑：TZY

原文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.3c04534

文章引用：DOI: 10.1021/jacs.3c04534