今天为大家介绍的是最近在Nature Biomedical Engineering上报道的一篇标题为 “Exosomes decorated with a recombinant SARS-CoV-2 receptor-binding domain as an inhalable COVID-19 vaccine” 的文章。该文的通讯作者是北卡罗来纳大学生物医学工程中心的Ke Cheng教授团队与Zhenhua Li 教授团队。在本文中，作者将新冠病毒表面受体结合区（Receptor-Binding-Domain, RBD）偶联到肺球状细胞（Lung spheroid cells, LSC）的外泌体（Exosome）表面，形成的可吸入式疫苗能够有效地在肺部及呼吸系统中刺激粘膜免疫，在假病毒和活病毒的动物实验中都取得了良好的免疫激活效应以及病毒阻断结果。 

    自从2019年SARS-CoV-2新型冠状病毒肺炎疫情爆发以来，全球有许多国家陆续批准了针对Covid-19的疫苗。这些疫苗大多数需要肌肉注射，产生的抗体在血液中循环，但不一定会引起强大的黏膜免疫反应。且由于mRNA的不稳定性，这些疫苗的保存及运输条件比较苛刻，需要完善的冷链用于长时间储存，因此成本高昂。

    SARS-CoV-2刺突蛋白S1亚基的RBD与宿主气道上皮血管紧张素转换酶2(ACE2)受体结合，使病毒能够进入细胞。因此，RBD有可能作为产生中和抗体的靶点而刺激人体免疫系统，但需要有效的药物递送系统。病毒样颗粒(Virus-Like-Particles, VLPs)是一种有效的药物传递载体，其中，外泌体是体内自然产生的一种细胞外囊泡，因为它们表达来自亲本细胞的表面蛋白质和受体，所以它们在靶向相同的组织受体细胞方面具有优势。因此，该作者团队将SARS-CoV-2的RBD偶联到LSC外泌体表面，开发了一种有效靶向肺部上皮细胞的可吸入疫苗。他们通过RBD-PEG_5k-DSPE将RBD偶联在外泌体表面，构成RBD-Exo，这种外泌体疫苗可以在室温下保存，并且在动物模型中激活强大的黏膜免疫和中和抗体，从而对病毒有着强效的抑制作用。（图1）

图1. 吸入式RBD-Exo VLP疫苗的构造示意图，

其能在多种动物模型中发挥强效黏膜免疫刺激功能

    作者团队首先比较了RBD-Exo与传统mRNA疫苗采用的脂质体（Lipo）的传递靶向性和效率。他们将RFP封装在LSC的外泌体中，通过雾化给药的方式观察了Exo和Lipo在体内的生物分布。肺部的体外成像显示，被递送到肺部和气管组织中的RFP-Exo外泌体明显多于脂质体，并能够分布于整个肺器官中。同时，外泌体也能够有效地增加抗原呈递细胞摄取抗原的水平。（图2）

图2. 负载RFP的LSC-Exo颗粒的肺部分布

    随后，该团队表征了这种VLP的各类性质。DSPE-PEG_5k-NHS被用来与SARS-CoV-2的RBD蛋白偶连，并与LSC Exo混合，纯化。SDS-PAGE证明了这种方法可以实现较高的偶联效率，并形成100 nm左右的颗粒。更重要的是，RBD-Exo可以冻干为粉末，其稳定性非常优异。经过水复溶后保存在室温条件下超过三周，形态和结构均保存良好，RBD-Exo的浓度以及外泌体膜上偶联的RBD水平均没有发生明显变化。这些数据表明，RBD-Exo在常温或低温下都具有较高的物理和抗原稳定性，优于现有的mRNA脂质体疫苗。（图3）

图3.  RBD-Exo外泌体疫苗的表征及其稳定性测试

    在这之后，该团队用SARS-CoV-2假病毒模型在小鼠体内检验了RBD-Exo激活免疫系统的能力。分别通过静脉注射和吸入给药RBD-Exo，并在2周后用假病毒感染小鼠。该团队发现，相比静脉注射的方法，吸入给药RBD-Exo后产生抗体的速率和滴度都明显较高，而且主要产生由Th2型T细胞辅助产生的IgG2a抗体，静脉给药则主要产生IgG1型抗体，前者相比于后者对病毒有更强的中和作用。同时，吸入给药RBD-Exo还能够刺激肺部上皮组织中产生SIgA，标志着肺部黏膜免疫的发生，这种分泌型IgA抗体能阻断病毒跨过呼吸系统黏膜，起到更好的阻断效果。对肺部免疫细胞的分析也表明，有着更多的抗原特异性T细胞被活化，标志着吸入式RBD-Exo的高效免疫激动作用。（图4）

图4.  接种RBD-Exo疫苗可以诱导抗体的产生，并增强小鼠对SARS-CoV-2假病毒的清除

    最后，该团队在叙利亚金仓鼠模型上检验了RBD-Exo吸入式疫苗对SARS-CoV-2活病毒的抑制作用。采用逆转录实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测口腔拭子(OS)和支气管肺泡灌洗液(BAL)中的病毒载量。结果发现，RBD-Exo疫苗组仓鼠体内的病毒数量显著降低，抗体滴度则有大幅度的增高。对肺部组织的苏木精-伊红（H&E）染色也能够发现，SARS-CoV-2本可能导致的肺部纤维化和炎症现象均得到了很大程度上的缓解。这证明了RBD-Exo病毒疫苗在对抗活病毒时也同样有效。（图5）

图5. RBD-Exo疫苗对SARS-CoV-2活病毒感染仓鼠模型的抑制和肺部保护作用

    综上所述，该工作报道了一种基于肺部球状细胞外泌体的吸入式SARS-CoV-2疫苗。由于外泌体与分泌细胞的膜同质性，这些外泌体能很容易地靶向到特定细胞，体内分布实验证明了这种疫苗良好的肺部靶向能力。同时，这种疫苗能够刺激黏膜免疫，产生数量很多的各类RBD中和抗体，用于SARS-CoV-2入侵体内后的黏膜保护和中和阻断，并在小鼠和仓鼠身上分别进行了假病毒和活病毒实验，均有着良好的疗效。由于外泌体囊泡制备的流程简便，且稳定性良好，能够耐受常温水环境，因此该吸入式疫苗有着极佳的应用前景，有望成为替代mRNA脂质体疫苗的新一代SARS-CoV-2疫苗。

作者：DYH    审校：LXY

DOI: 10.1038/s41551-022-00902-5

Link: https://www.nature.com/articles/s41551-022-00902-5