给大家分享一篇近期发表在ACS Cent. Sci.上的文章，题为Tyrosinase-Mediated Synthesis of Nanobody−Cell Conjugates。文章的通讯作者是来自加州大学伯克利分校的Matthew B. Francis教授。

    细胞是生命活动的基本单位，调控细胞表面的能力在基础科学与实际应用中均备受关注。除基因工程的方法外，直接将复杂分子连接到细胞表面的化学方法也逐渐涌现。对细胞进行化学修饰有许多条件上的限制。包括但不限于：需要在生理pH值下的缓冲溶液中完成，并且需要较快的动力学实现高转化率。因此开发细胞的化学修饰方法具有极大的挑战。

    在作者前期的研究中发现，如图1a所示，使用酪氨酸酶（abTYR）将酪氨酸氧化为邻醌，可用于修饰蛋白质的N末端或蛋白质表面的硫醇基团。在本文中，作者尝试拓展这一化学方法，实现酪氨酸标签蛋白与细胞表面的连接。如图1b所示，纳米抗体（目标蛋白）的C末端以酪氨酸修饰，在被酪氨酸酶催化后，能够与细胞表面的内源性亲核试剂反应，并连接在细胞表面。

图1. 使用酪氨酸酶修饰蛋白/细胞的通用策略

    类似于T细胞，NK细胞也具有细胞毒性功能，向人体输入NK细胞也是免疫疗法的一个重要分类。然而部分NK细胞系不表达Fc受体，限制了他们在抗体依赖性细胞杀伤中的作用，因此使用具有抗原结合功能的蛋白质修饰细胞能够直接孵育其靶向性。

    首先，作者测试了酪氨酸酶催化酪氨酸标签蛋白附着在细胞表面的能力。作者将针对GFP的纳米抗体nbGFPTyr与酪氨酸酶孵育，ESI-TOF质谱分析表明，nbGFPTyr在10分钟内完全转化为单一氧化产物（图2a）。随后，为了验证纳米抗体与细胞表面的连接，将NK细胞与nbGFPTyr及abTYR共同孵育，随后使用GFP进行二次标记，如图2b所示。使用流式细胞仪分析的结果如图2c所示，仅同时使用纳米抗体与酪氨酸酶处理的细胞检测到荧光的增加，这表明纳米抗体成功与细胞表面连接，同时附着的抗体保留了抗原结合能力。

    为了确定附着在细胞表面的纳米抗体的数目，作者使用单位点特异性荧光标记的纳米抗体nbFITC与NK细胞连接。并将nbFITC标记的细胞与含有已知数量FITC分子的校准珠比较。如图2d所示，使用这一方法能够确定修饰在细胞表面的纳米抗体数量，同时，这一结果也表明，通过调整纳米抗体的浓度，能够合理调整修饰在细胞表面的的蛋白数量。

图2. abc 酪氨酸酶催化纳米抗体修饰细胞表面

d 测定细胞表面修饰的蛋白数目

    接下来，作者就探究了纳米抗体-细胞偶联物在靶向性细胞-细胞相互作用中的能力。使用针对人表皮生长因子2（HER2）的抗体nbHER2Tyr与NK细胞偶联，并使用Mitotracker染料（红）标记制备得到的偶联物。HER2+细胞系SK-BR3用绿色染料标记，两种细胞以2:1混合，如图3a所示。使用荧光显微镜成像并通过临近分析确定接触绿色目标细胞的红色NK数量。结果如图3ab所示，仅在使用nbHER2Tyr和abTYR处理的NK细胞中观察到形成细胞-细胞接触的“玫瑰花”形状，且其中更大比例的靶细胞被NK细胞结合。

图3.纳米抗体-细胞偶联物的靶向性细胞-细胞相互作用

    最后，作者探究了纳米抗体-NK细胞偶联物靶向杀伤细胞的能力。如图4所示，HER2+的细胞SK-BR3内预先加入钙黄绿素染料。在细胞死亡后，细胞膜通透性提高将使染料释放到培养液中。荧光测定的结果显示，仅nbHER2Tyr和abTYR处理的NK细胞观察到统计学显著的细胞毒性。

图4.纳米抗体-细胞偶联物靶向性细胞杀伤

    总体而言，本文中开发了一种使用酪氨酸酶合成蛋白-细胞偶联物的方法，由此产生的偶联物产生了新的抗原结合功能，能够在模型细胞系中靶向细胞死亡。预期这一方法有助于将各种类型的蛋白质结合到细胞表面。

作者：ZRC    审校：SYM

DOI: 10.1021/acscentsci.1c01265

Link: https://doi.org/10.1021/acscentsci.1c01265