给大家分享一篇发表在JACS上的文章，题为：Platform for Orthogonal N‑Cysteine-Specific Protein Modification Enabled by Cyclopropenone Reagents。本文的通讯作者是来自西班牙Basque Research and Technology Alliance (BRTA)的Gonzalo Jiménez-Osés和来自剑桥的Goncalo J. L. Bernardes。

    蛋白质偶联物，如抗体药物偶联物(ADC)和聚乙二醇化蛋白质等，都具有重要的医用价值。在用于蛋白质偶联的各种策略中，天然氨基酸的修饰仍然是首选方法，因为它直接、便捷，无需通过遗传学手段改变蛋白质序列。理想情况下，偶联反应需要具有位点选择性，且化学反应完全，以生成结构明确的蛋白质偶联物，这是ADC等多种医药领域应用的关键要求。同样，这种转变应在室温和生理 pH 值的水溶液环境中迅速发生。尽管近年来已经开发了许多蛋白质偶联策略，但当蛋白质中存在其他具有相似反应性侧链时，修饰蛋白质上的一个特定氨基酸仍然是一个挑战。

    赖氨酸和半胱氨酸是生物偶联中修饰最多的氨基酸，因为它们在生理条件下是亲核的。天然赖氨酸残基是非常便于修饰的位点，但它们在蛋白质表面很丰富，因此很难对给定的残基实现高度选择性。相反，半胱氨酸残基在蛋白质中的丰度较低 (<2%)，位点选择性更好。然而，当依赖半胱氨酸残基进行蛋白质修饰时，必须考虑以下几个因素。首先，半胱氨酸残基通常会形成对蛋白质结构至关重要的二硫键，对这些残基进行修饰会导致蛋白质功能丧失。此外，许多表面暴露的内源性半胱氨酸残基直接关系到蛋白质的催化活性，因此不能用于修饰。所以，如何在一种蛋白质中区分不同半胱氨酸残基的方法具有重要的意义。因此，研究人员已经开发了许多N端半胱氨酸的修饰方法(图1)。

    本文作者利用环丙烯酮(CPO)官能团，设计了一种单取代的CPO试剂，用于蛋白质或多肽N末端半胱氨酸的特异性修饰。在这个设计中，单取代的CPO能够在温和的、生物友好的环境下，与N 端半胱氨酸残基的 1,2-氨基硫醇基团反应，生成稳定的1,4-thiazepan-5-one(图1)。即使蛋白质中还存在其他暴露在溶剂中的半胱氨酸残基，也仍然可以选择性地只修饰N端的半胱氨酸。

图1. N端半胱氨酸特异性修饰的方法

    为了证实这一点，作者用TCEP将一个用二硫键连接的环肽血管加压素(P5)断开，使得短肽上暴露出两个半胱氨酸的巯基，当P5与2-氰基苯并噻唑(CBT)反应时，可以同时得到单位点修饰和双位点修饰的产物，而CPO却选择性的只与N末端的半胱氨酸反应(图2)。

图2. CPO特异性修饰多肽N端的半胱氨酸

    同样，这种方法不仅适用于简单的多肽，还适用于复杂的蛋白质体系。作者将同时包含N端半胱氨酸和蛋白内半胱氨酸的双突变GFP(2×cys-GFP)与CPO-PEG反应，在二硫苏糖醇(DTT)环境下能够顺利形成GFP的PEG偶联物。并在除去多余的CPO和DTT后，蛋白质内半胱氨酸还能与苯甲酰丙烯酸反应(图3)。而在缺少DTT的环境下，则会迅速(<5 min)形成蛋白质二聚体。

图3. 用CPO-PEG 和苯甲酰丙烯酸试剂选择性修饰 2×cys-GFP

    除此以外，基于 CPO 的试剂能够在两种蛋白质之间进行无铜点击反应。从头设计的 cys-nIL2 就是一个很有趣的应用场景。因为与单体 nIL2 相比，二聚化会增强与 IL2-β受体的结合。因此，作者用CPO-N3和CPO-DBCO 分别处理 cys-nIL2，然后将两种正交标记的蛋白质混合，二聚体 (nIL2)₂ 在30分钟内就能够形成(图4)。

图4. 使用基于 CPO 的化学方法制备 cys-nIL2 的共价二聚体

    综上所述，作者开发了一种有效的方法来选择性地修饰肽和蛋白质上的 N 末端半胱氨酸残基。利用CPO试剂进行正交修饰，与常见的还原剂二硫苏糖醇 (DTT) 兼容，更便于处理易于二聚化的蛋白质。并且区分和特异性靶向蛋白质上的 N 末端半胱氨酸残基的能力有助于构建精细的多标记生物偶联物。

作者: HYH    审校: LXY

DOI: 10.1021/jacs.2c02185

Link: https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.2c02185