分享一篇最近发表在Nature Chemistry上的文章，O-GlcNAcylation modulates liquid–liquid phase separation of SynGAP/PSD-95。这篇文章的通讯作者是北京大学化学与分子工程学院的陈兴教授和北京大学药学院的董甦伟教授。

    蛋白质的液液相分离(LLPS)在活细胞内的动态划分中起着重要作用。真核细胞中，除了膜包被的细胞器之外，还包含着大量由LLPS形成的无膜细胞器，例如核仁中的RNA蛋白颗粒、和PML核小体，以及细胞质中的应激颗粒等等，这里面含有特定的核酸和蛋白质，在细胞中发挥着重要功能。同时液液相分离也是地球原始生命阶段原始细胞出现的关键热力学过程，因此对于它的研究受到了广泛的关注。相分离液滴主要由蛋白质、DNA或RNA等生物大分子组成，LLPS过程主要是由多价缔合作用驱动的，尤其是静电相互作用、π-π相互作用等，其中蛋白质中的天然无序序列也被认为在LLPS中起到了重要的作用。

    蛋白的翻译后修饰可以通过改变氨基酸残基间的相互作用强度实现对LLPS的动态调控，比如精氨酸的甲基化修饰可以减弱其与芳香基团的相互作用，从而抑制LLPS；磷酸化修饰还可以在不同的相分离体系起到不同的调控作用。但一种在高等生物中更常见的翻译后修饰——糖基化修饰，还未被系统地阐释其在LLPS中所起到的作用。O-GlcNAc糖基化修饰是一种发生在细胞内的简单而广泛的蛋白质后修饰，并且在神经元突触蛋白上广泛存在。其中SynGAP被发现具有多个O-GlcNAc修饰的位点，并且它是突触后密集区(PSD)中最丰富的蛋白之一，具有GTP酶激活蛋白(GAP)活性。前人的研究工作发现SynGAP-α1与PSD-95（PSD的中心脚手架蛋白之一）可以通过特定结构域之间的特异性相互作用形成复合物，并诱导形成LLPS。但是目前尚不清楚O-GlcNAc修饰是否在其中调控了SynGAP/ PSD-95复合物LLPS。

    为了阐明O-GlcNAc在蛋白特定位点修饰的功能，作者在本文中采用蛋白质半合成策略，合成了位点特异的O-GlcNAc修饰的 SynGAP，并研究了其在体外体内与PSD-95形成复合物的能力。

图1.  EPL合成位点特异的O-GlcNAc修饰的SynGAP CC-PBM表明T1306 O-GlcNAc修饰抑制LLPS

    由于SynGAP与PSD-95形成复合物是SynGAP中的CC-PBM结构域与 PSD-95中的PSG结构域的相互作用诱导的，作者选择了CC-PBM结构域中1159位丝氨酸(S1159)与1306位苏氨酸(T1306)两个位点进行O-GlcNAc修饰。作者利用表达蛋白连接(expressed protein ligation, EPL)策略合成了S1159与T1306位点特异的O-GlcNAc修饰的SynGAP CC-PBM蛋白，并对它们的结构进行了确认（图1a-f）。接着，作者在液滴成像实验与沉淀离心实验和延时荧光摄影等实验中发现，SynGAP-T1306^OG会抑制SynGAP与PSD-95的LLPS的形成(图1g-h)。作者认为T1306 O-GlcNAc修饰降低了SynGAP CC-PBM与PSD- 95之间的相互作用，从而抑制它们复合形成LLPS。作者结合同源结构模拟与体积排阻-静态光散射等手段验证了这一机理，提出SynGAP蛋白T1306位点的O-GlcNAc修饰通过阻碍T1306与PSD-95蛋白369位组氨酸间形成氢键，破坏蛋白相互作用进而阻碍LLPS形成。

    O-GlcNAc修饰通常是亚化学计量，即修饰率不足100%。因此亚化学计量的O-GlcNAc修饰能否有效地调控LLPS是一个重要的问题。作者假设SynGAP T1306 O-GlcNAc能以显性负向方式抑制SynGAP/PSD-95的LLPS，也就是说，对SynGAP进行O-GlcNAcylation会比去除等量的SynGAP蛋白更有效（图2a）。本文实验结果证明，不同修饰率（10% ~ 100%）均可以对LLPS产生不同程度的抑制，并且与通过降低蛋白浓度抑制LLPS的方式相比，等比例的O-GlcNAc修饰对LLPS具有更明显的抑制效果，即O-GlcNAc对于LLPS的抑制呈现出显性负调控（dominant-negative effect）的特征（图2b-c）。此外，作者还发现O-GlcNAc修饰对LLPS的抑制是动态可逆的，通过加入O-GlcNAc转移酶OGT或去修饰酶OGA可以动态地调节O-GlcNAc水平与LLPS阈值。

图2.  O-GlcNAc以显性负性方式调控SynGAP/PSD-95 LLPS

    总的来说，在这篇文章中，作者利用蛋白质半合成策略，合成了位点特异的O-GlcNAc修饰的 SynGAP，并证明SynGAP的T1306 O-GlcNAc可以阻碍其与PSD-95的相互作用，从而抑制LLPS。更重要的是，O-GlcNAc修饰对SynGAP/PSD-95 LLPS的抑制呈显性负向，这使得亚化学计量的O-GlcNAc修饰能够有效发挥调控作用。最后，作者还证明了O-GlcNAc依赖的LLPS受转移酶OGT和去修饰酶OGA的可逆调控。根据这些实验结果，作者推测SynGAP T1306上的O-GlcNAc可能通过阻碍PSD-95/SynGAP LLPS来抑制神经元中PSD凝聚体的形成。作者猜测，普遍存在的O-GlcNAc修饰可能是各种LLPS过程的通用调节因子，并且，O-GlcNAc也可能参与调节蛋白的聚集，如tau和α-synuclein，这些蛋白的聚集可能涉及LLPS。这篇文章的结果是证明一个蛋白上特定位点的修饰会抑制LLPS，但需要注意的是，O-GlcNAc也可能促进蛋白质之间的相互作用，因此，目前O-GlcNAc是否对LLPS有促进作用仍然是一个悬而未决的问题，是今后研究的一个方向。

作者：ZHS    审校：SYM

DOI: 10.1038/s41557-022-00946-9

Link: https://doi.org/10.1038/s41557-022-00946-9